周守毅， 周守琳， 张欢燕
（上海市环境监测中心，上海200235）
摘要：建立了同相萃取-反相高效液相色谱一质谱法对水体中磺胺类、四环素类、头孢类、氯霉素等20种抗生素筛查方法。采用水（含0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸铵）：甲醇（含0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸铵）作流动相，分别使用电喷雾正离子源和负离子源进行离子化，动态多反应监测方式( DMRM)对20种抗生素的母离子及子离子进行监测。采用外标法定量时，抗生素方法的检出限为0.5～2.5ng/L，R>0.99，回收率介于79.2‰125.5%。
关键词：高效液相色谱-质谱； 抗生素； 快速筛查
中图分类号：X832 doi：10.3969/j.issn．1003-6504.2016.06.019 文章编号：1003-6504(2016)06-0101-04
抗生素( antibiotics)是生物包括微生物、植物和动物在内在其生命活动过程中所产生的（或由其他方法获得的），能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物功能的有机物质。与农药、多氯联苯、POPs等化学品所引起的环境问题受到的长期、广泛关注相比，抗生素作为人们日常生活接触最为频繁，用量最大的一类化学品，其环境行为和效应直到1990年代后期才受到关注。我国是抗生素的生产和使用大国。2003年仅青霉素产量就为28000t，占世界总产量的60%；土霉素产量10000t，占世界总产量的65%;四环素产量也为世界第一，在我国的水体中，如九龙江、黄河、黄浦江、海河及巢湖等均检测到了不同程度的抗生素污染。抗生素的生态影响主要表现在两方面：一方面将导致环境中耐药菌的出现，并大量繁殖和传播，最终人类健康造成影响；另一方面通过影响水生生物、动植物的营养传递方式和种群结构以及微生物的种群数量，生态环境中固有的食物链将会遭到破坏，进而打破生态系统的平衡。因此，对水体中抗生素污染的监测具有重要的意义。本文以水（0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸铵）：甲醇（0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸铵）为流动相，通过梯度洗脱分别在正、负离子化的条件下对20种抗生素进行定性筛查，本法操作简单、重现性好、检出限低，可用于地表水中抗生素筛查和一些基质简单水体的定量分析。
1实验部分
1.1仪器与试剂
Autotrace全自动固相萃取仪（美国ThermoFisher公司）；1290高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；6460三重四级杆质谱仪（美国Agilent公司），配有喷射流技术的电喷雾电离源(AJS)及MassHunter Workstation数据处理系统，氮吹仪（美国Organomation公司）Oasis HLB 200 mg 6cc小柱（美国Waters公司），Bond Elute PLEX PAX 200 mg，6cc小柱（美国Agilent公司）。
四环素( Tetracycline，>98%)、土霉素(Oxytetr -acycline，>98%)、氯霉素( Chloramphenicol，>98%)、磺胺嘧啶( Sulfadiazine，>99%)、磺胺二甲嘧啶( Sulfa-methazine，>99%)、磺胺甲恶唑( Sulfamethoxazole．>98%)、阿莫西林(Amoxicillin，>99%)均为固体微末标样，购自美国DR．Ehrenstorfer公司。磺甲硝咪唑( Tinidazole)、林肯霉素(Lincomycin)、头孢唑肟( Ceftizoxime)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟哌酸( Pefloxacin)、培氟沙星(Norfloxacin)、环丙沙星( Ciprofloxacin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、克林霉素( Clindamycin)、青霉素G(Penicillin G)、交沙霉素( Josamycin)、红霉素(Erythromycin)、道诺霉素( Daunoru bicin)共13种标样浓度为1x10-6，由安捷伦中国有限公司提供。
试剂：甲醇、水均为液质纯（德国Merk公司）、甲酸为色谱纯（美国Dikma公司）和甲酸铵纯度>99.0%（美国Fluka公司）、0.47μm孔径玻璃纤维滤膜（美国What man公司）。盐酸为优级纯（美国Merk公司）和氨水为色谱纯（美国Fluka公司）。储备标准溶液的配
制：称取适量的抗生素固体标准品溶于100 m L甲醇中，-20℃下避光保存。各个浓度的标准工作溶液由储备标准溶液序列稀释而成。
1.2样品的采集、萃取与浓缩
在上海市某河道采集水样，每升水样加入0.5 gNaE DTA，用棕色玻璃瓶避光低温保存。
将水样过0.47μm玻璃纤维滤膜去除颗粒物，用盐酸和氨水分别调节水样pH到3、5、7和11。抗生索水样萃取条件如表1所示，回收率范围在79.2%~125.5%。
HLB小柱前处理流程：依次用10 m L甲醇、10m L纯水预淋洗后，然后以5 m L/min流速将水样通过固相萃取小柱。上完样后，用6 m L纯水淋洗小柱，再将小柱于氮气保护下干燥5 min，最后用5 m L0.1%甲酸的甲醇溶液洗脱2次，收集洗脱液在50℃下用氮气吹干，用甲醇／水( 1:9，V/V)溶液定容至1.0m L，然后用0.22μm的针头式过滤器过滤后待LC-
MS-MS分析。
PAX小柱前处理流程：依次用6 m L甲醇、6 m L纯水预淋洗后，然后以5 m L/ min 流速将水样通过固相萃取小柱。上完样后，用6 m L纯水淋洗小柱，再将小柱于氮气保护下干燥5 min，最后用4 m L 5%甲酸的甲醇／水（1/9，V/V溶液洗脱，将洗脱液过0.22μm的针头式过滤器后待LC-MS-MS分析。
1.3 色谱与质谱条件
色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD液相色谱柱（2.1 mmxl00 mmx1.8μ m），柱温30℃，流动相A为0.1%甲酸和0.5 m mol/L甲酸铵水溶液；流动相B为0.1%甲酸和0.5 m mol/L甲酸铵的甲醇溶液，流速0.3 m L/min，梯度洗脱：0～0.5 min，10% B;0.5～8 min,10%～32% B;8～9.5 min,32%～65% B;9.5～14 min,65%～75%B；14～15 min，75%～80%B，进样量：10μL。
质谱条件：电喷雾源(AJS)，采用动态多反应监测( DMRM)，毛细管电压4 000 V，源温度350℃，鞘气温度400℃：MS1和MS2温度为100℃，干燥气流速6 L/min，鞘气流速12 L/min。
2结果与讨论
2.1 LC-MS/MS条件
比较甲醇和乙腈为流动相的实验结果显示：甲醇为流动相时，基线稳定，各分析物分离良好。在流动相中加入适量甲酸和甲酸铵可以增加抗生素的保留，并改善峰形，促进离子化。因此本实验采用0.1%甲酸和0.5 m mol/L甲酸铵混合溶液和甲醇作为流动相，大部分化合物都得以较好分离，峰形良好。
除氯霉素以[M—Hr准分子离子作母离子，其他化合物均以[M+H]+准分子离子作母离子。各抗生素的特征离子以及其他主要的LC-MS/MS参数见表2。
2.2定性与定量分析
每种抗生素均选择一组母离子对于一组子离子对进行监测。当样品中组分的保留时间与标准品一致，并且2个离子对的响应值比例与标准品相对标准偏差<20%，方可确认为目标物。
在对水体中抗生素定量分析时，基质效应影响很大。通常，基质效应可导致分析物信号增减，进而影响定量的准确性和可靠性。一旦确认基质效应无法消除，须用同位素内标进行准确定量。
由于抗生素种类繁多，同位素内标物价格昂贵且部分物质购买受到管控，本方法在定量时采用外标法并使用稀释和基质加标的方法降低基质效应，所以只适合抗生素筛查和一些基质简单的水样分析。采用外标法定量时，本方法的检出限为0.5～2.5 n g/L，R>0.99，回收率介于79.2%～125.5%。
2.3样品的测定
应用本方法分析了某处水样，检出磺胺类和四环素类抗生素（见图1），含量在0.091～0.121μg/L之间（表3），相对标准偏差在3.2%~12.5%之间（n：2）。
