李明智1，2，张宇1，2，梅荣武1，2，韦彦斐1，2，王慧荣1，2，陈潜3，楼继锋3，厉林聪3
（1．浙江省环境保护科学设计研究院工程技术研究中心，浙江杭州310007；2．浙江环科环境研究院有限公司，浙江杭州310007；3．杭州余杭水务有限公司，浙江杭州311100）
摘要：利用Bio log ECO技术对余杭污水处理厂污泥原位减量示范工程的活性污泥微生物多样性进行分析。结果表明：实验组利用全部（6类）碳源能力得到增强，群落的丰富度、均匀度和多样性具有显著提高；实验组对酚酸类、胺类碳源的利用度远高于对照组；其中对a-D-乳糖、L-苯基丙氨酸、a-环式糊精.4-羟基苯甲酸、苯乙胺等5种碳源的利用能力显著提高。综合分析表明，菌剂强化后可使活性污泥微生物群落得到优化，使得生化系统对碳源利用的深度和广度均有较大提高。
关键词：活性污泥；原位减量；Biolog ECO技术；微生物多样性
中图分类号：X172doi:10.3969/j.issn．1003-6504.2016.06.010 文章编号：1003-6504(2016)06-0055-04
Bio log方法是根据微生物对碳源底物的利用能力的差异，来描述群落中微生物的动态变化。其原理是微生物在利用碳源过程中产生的自由电子，与四唑盐染料发生还原显色反应，颜色的深浅可以反映微生物对碳源的利用程度。该方法由美国的BIOLOG公司于1989年开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定。1991年，Garland等开始将这种方法应用于土壤微生
物群落的研究。
Bio log法借助于96孔微孔板，如革兰氏阳性板(GP)、革兰氏阴性板(GN)和生态板(ECO)等来实现。ECO板有6大类31种碳源，ECO板相对于GN板利用了更多生态有关的化合物，更适合于土壤微生物群落功能多样性研究。ECO微孔板技术可以解析微生物群落生理特征的变化，为描述微生物群落功能多样性提供了一种简单、快速的方法，在土壤微生物群落H
较、污染物对环境微生物群落的影响评价、环境修复效果的评价等方面得到广泛应用。
废水生化处理系统中的菌胶团（活性污泥）微生物含量丰富，其功能多样性适宜用ECO板分析。我们课题组在前期研究中通过不同污水处理厂生化系统微生物菌群的解析，定向筛选可分泌大量胞外酶的功能性菌群强化污泥分解作用；同时通过实践反复筛选获得可控性较理想的微型后生动物用于污泥的强化捕食，优化改善活性污泥生物相，最终形成了基于多生
境菌剂(multi-environmental microbial agent, MEMA)结合微型后生动物强化捕食的污泥原位减量技术，在现场中试获得良好效果的基础上在余杭污水处理厂的工程示范中获得40%以上的污泥减量效果，且出水水质得到改善，生化系统污泥性状得到优化。
本文采用Bio log技术对工程示范过程中活性污泥的微生物群落特征进行分析，比较实验组与对照组污泥微生物碳源利用特点，旨在为污泥原位减量技术的优化实施提供科学依据和理论指导。
1材料与方法
1.1实验材料
供试样品来源于余杭污水处理厂污泥原位减量工程示范研究中的实验组和对照组活性污泥，分别在调试运行第7天、30天和90天时间采取污泥样品，保存于本实验室4℃冰箱。
1.2实验仪器
Bio log Gen III Micro Stationr TM自动微生物鉴定系统、三洋MLR-352恒温培养箱。
1.3 Bio log实验
用移液枪取1 m L活性污泥到1.5 m L离心管中。在10 000 r/min下离心20 min，弃去上清液，加1 m L生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀；再于10 000r/min下离心20 min，重复2次，除去其中的碳源；弃去上清液，加1 m L生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀，于2 000 r/min下离心1 min。取上清液倒入装有20 m L已灭菌生理盐水(Na Cl，0.85% W/V)的试管中，并使其OD590维持在0.13+0.02。将上述稀释液加入Bio log ECO微平板中(100 m L／孔)，然后在22℃下培养，每隔12 h用Bio l og细菌自动读数仪读取750 nm和590 nm下数据，连续测定5d。
1.4计算方法
孔的平均颜色变化率(A WCD，average well colordevelopment)计算。
式中：C为每个碳源孔的2波段光密度差值；R为对照孔的光密度值；n为底物数量（GN板n=95,ECO板n=31）。
微生物代谢活性用590 nm下的值减去750 nm下的值表示，并且<0.06和>-0.06的值修正为0。
统计分析应用SPSS (Version10.0 for Windows)软件，绘图应用Origin 8软件。
2结果与讨论
2.1 2种活性污泥对全部碳源的动力学特征分析
平均颜色变化率是反映微生物代谢活性，即利用单一碳源能力的重要指标。实验分别取余杭污水处理厂实验组和对照组活性污泥进行ECO分析，结果见图1。计算31种碳源的A WCD可见，随着培养时间的延长，微生物利用碳源量呈逐渐增加的趋势。2次取样实验分析均表明实验组利用碳源总量在整个培养过程都显著高于对照组，说明通过添加功能菌剂能使生化系统微生物的生理活性得到较大提高。图1(a)、(b)对比可以看出实验组在经过3个月的运行后其污泥活性会比开始阶段略有减弱，但依然显著高于对照组。这说明功能菌剂的强化作用能够维持较长一段时间，通过后期适当的添补功能菌剂，可以保持生化系统一个较高的污泥活性，虽然系统排泥量减少很多，但不会影响污泥活性，从而保证出水水质的稳定。
2.2 2种活性污泥对不同种类碳源的动力学特征分析
按化学基团的性质可以将ECO板上的31种碳源分成6类（见表1），即碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、酚酸类、胺类和多聚类。不同微生物对不同种类碳源的利用度会有差别。实验分别统计每类碳源的AWCD情况(样品为运行1个月活性污泥)（见图2）。结果表明，实验组经过生物强化作用后与对照比在不同类型碳源利用上表现出差异性。功能菌剂的强化作用提高了实验组对碳水化合物类、氨基酸类、酚酸类、胺类4类碳源的利用度，特别是对酚酸类、胺类2类碳源的利用度要远高于对照(见图2(e)和(f）。而对多聚类、羧酸类2类碳源的利用度均比较高，两组之间没有差异(见图2(c)和(d），这说明这2类碳源比较容易被环境微生物所利用。
2.3 2种活性污泥生物多样性指数分析
ECO板反应孔的颜色变化数目在一定程度上可以间接反映土壤微生物群落结构组成上的差异，颜色变化孔数越多表明微生物群落种类相对越丰富。通常把颜色变化孔数作为微生物功能多样性的丰富度(S)。由表2可知，经过生物强化作用的实验组平均96 h显色孔数分别达到26目和25目，而对照为21目，实验组微生物群落丰富度提高21.0%。Shannon指数(H)是研究群落物种及个体数和分布程度的综合指标，是应用最为广泛的群落多样性指标之一。由表2可知，经过生物强化作用实验组Shannon指数平均为1.29，对照组为1.15，Shannon指数提高10.8%。均匀度指标(evenness，E)反映微生物利用所有碳源基质的平均活性水平。由表2可知，经过生物强化作用实验组E值要比对照组提高10.3%。研究表明，实验组在经过功能性微生物菌剂强化后，其群落丰富度、多样性以及均匀度均比对照组有显著提高。
2.4 活性污泥微生物群落功能多样性主成分分析
以上分析结果表明，经过生物强化的实验组微生物群落对碳源利用能力得到显著提高，为了进一步明确微生物群落对各种碳源的利用情况，本节将培养96 h的ECO数据进行标准化转换后进行主成分分析( principal component analysis，PCA)，通过主成分分析可以将不同样本的多元向量变换为互不相关的主元向量（PC1和PC2是主元向量的分量），在降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映出不同微生物群落的代谢特征，结果见图3，经过不同时间生物强化处理后，在31中碳源构建的主成分体系中存在明显的空间分布差异，其中经生物强化处理1周的活性污泥与对照差别不大，经处理1个月和3个月的活性污泥与对照具有显著差异。经过PC1轴上最影响碳源利用的载荷值相关分析，D-半乳糖酸-y-内酯、D-纤维二糖、a-D-乳糖、a-D-葡萄糖-1-磷酸、D-木糖、D-甘露醇、L-苯基丙氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸-L-谷氨酸、y-羟丁酸、衣泰酸、a-丁酮酸、a-环式糊精、2-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙胺等17种碳源与PC1成正相关，说明经过生物强化处理后活性污泥增强了对这些碳源的利用，特别对a-D-乳糖、L-苯基丙氨酸、a-环式糊精、4-羟基苯甲酸、苯乙胺等5种碳源的利用能力得到较大提高。而对D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温80、腐胺等4种碳源的利用能力略有减弱。主成分分析表明，生化系统经过污泥减量功能菌剂的生物强化之后，活性污泥对碳源的利用率有了较大提高，说明其微生物群落发生了变化从而影响其功能的差异。
3结论
前期研究明确利用多生境菌剂结合微型后生动物强化捕食的污泥原位减量技术可在不影响出水水质情况下获得较好的污泥原位减量效果，实验组污泥沉降性能和脱氢酶活力得到提高，这些说明活性污泥生物相得到优化。本文对余杭污水处理厂污泥原位减量示范工程的活性污泥微生物多样性进行分析，得出如下结论：
(l)Bio log ECO结果表明实验组利用全部碳源的能力显著高于对照组，并且在运行3个月后其污泥活性仅比开始阶段略有减弱，说明多生境菌剂的强化作用使得生化系统保持一个较高的污泥活性，从而保证出水水质稳定。
(2)不同种类碳源的动力学特征分析表明多生境菌剂的强化作用提高实验组对碳水化合物类、氨基酸类、酚酸类、胺类4类碳源的利用度，特别是对酚酸类、胺类2类碳源的利用度要显著高于对照。同时，实验组的群落丰富度、均匀度以及多样性均有显著提高。
(3)主成分统计分析表明，实验组强化了对D-半乳糖酸- Y-内酯等17种碳源的利用能力，其中对仅-D-乳糖、L-苯基丙氨酸、a-环式糊精、4-羟基苯甲酸、苯乙胺等5种碳源的利用能力得到极显著提高。生化系统经过菌剂强化后对碳源利用的深度和广度均有了较大提高，说明其微生物群落得到了优化从而表现出功能的差异。
