赵敏1，窦冰然3，骆海燕1，洪厚胜1，2*
1．南京工业大学生物与制药工程学院（南京210009）；2．南京汇科生物工程设备有限公司(南京210009)； 3．南京工业大学化学与分子工程学院（南京210009）
摘要以新鲜苹果为原料，探讨了摇瓶液态深层发酵法制备苹果醋的生产工艺。并以所得苹果醋为原料先过滤除菌，然后研究不同调味剂配比得到酸甜适口的苹果醋饮料。结果表明，苹果醋发酵最佳条件为接种量1%,初始底酸量2%,初始酒精度5%vol。苹果醋调味确定最佳配方是蜂蜜4%,苹果醋4%，有机酸0.09%，黄原胶0.4%，蔗糖7%及苹果汁16%。该工艺酿造及调味出的苹果醋酸味柔和并具有苹果的清香。
关键词 苹果醋；发酵；正交试验：饮料
苹果是我国主要的水果产品之一，除去鲜食外，主要是加工生产浓缩苹果果汁。但由于苹果的产量在逐年递增，苹果产区常会面临卖果难的问题。苹果醋是近几年兴起的苹果加工产品，有利于缓解苹果的综合利用问题。另外，苹果醋不仅含有醋的食疗保健功效还富有苹果的营养物质和风味口感。苹果醋饮料则是以苹果醋作为酸味剂，再辅以纯天然营养保健成分制成的具有保健功能的风味独特的饮料。试验是对苹果醋发酵工艺与饮料调味的探索，旨在为工业大规模生产提供实践参考。
1材料与方法
1.1菌种
安琪酿酒高活性干酵母、液态发酵醋酸杆菌：实验室保藏。
1.2培养基
斜面培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，无水CaCO32g，琼脂2 g，蒸馏水100 m L，在121 0C、0.1 M Pa条件下灭菌20 min后冷却至60℃，加入3 m L无水乙醇。
种子培养基：葡萄糖1g，酵母粉1g，水100 m L，在121℃、0.1 M Pa条件下灭菌20 min后冷却至60℃，加入3.5 m L无水乙醇。
1.3主要原料与试剂
苹果：新鲜市售；柠檬酸、无水氯化钙、硫酸铜、浓硫酸、次甲基蓝、碘、碘化钾、95%食用酒精、乙酸、酚酞、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、碳酸钙、琼脂、酵母膏：分析纯；蜂蜜、蔗糖、苹果酸、柠檬酸、黄原胶：食品级。
1.4主要设备与检测方法
1.4.1主要设备
BS124S型分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；YSQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；GZX-9140 MBE型电热恒温鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂：WYA阿贝折光仪：上海精密科学仪器有限公司；PHS-3C pH计：上海精密科学仪器有限公司；HH-2恒温水浴锅：江苏金坛市宏华仪器厂；SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司；15 L自吸式发酵罐：南京汇科生物工程设备有限公司；PL-G( T)*1-1000单管式超滤膜：安徽普朗膜技术有限公司。
1.4.2检测方法
可溶性固形物含量检测：折光法；还原糖（以葡萄糖计）含量检测：快速费林法；酒精含量检测：蒸馏法；总酸（以醋酸计）含量检测：氢氧化钠滴定法；pH检测：酸度计法；氨基态氮含量：按国标GB5009.39-2003测定；总菌群：按国标GB 47892-2010测定。
1.5菌种活化
1.5.1酿酒高活性干酵母
称取所需量的活性干酵母加入2%的蔗糖水，在36℃～40℃下处理15～20 min，然后将温度降至34℃继续活化1～2 h。过程中有大量气泡产生需搅拌消泡，一般无泡产生时即可使用。
1.5.2醋酸菌
将醋酸杆菌接种在斜面培养基，并放置于恒温培养箱中30℃培养48 h，然后在种子培养基中接种醋酸杆菌（250 m L摇瓶50 m L装液量），培养温度为300C，摇床转速为200 r/min，培养48～72 h左右，得到活化好的醋酸菌种子液。
1.6苹果醋酿造工艺流程
1.7操作要点
1.7.1原料处理
苹果经清洗、破碎、榨汁后加入1.8 U/100 m L果胶酶在40℃下酶解100 min，在95℃下灭酶5 min，添加蔗糖调整苹果汁含糖量使固形物为10%左右为宜。
1.7.2酒精发酵
在苹果汁中接人0.35%活化好的酿酒高活性干酵母28℃恒温发酵。每隔12 h检测发酵液的糖度和酒度，基本4～5 d发酵完成。把得到的苹果酒醪静置沉降数天，取上层较清的苹果酒液进入醋酸发酵。
1.7.3醋酸发酵
采用摇瓶液态发酵法，把活化好的醋酸菌种子液接入发酵好的苹果酒中，在转速180 r/min，30℃摇床下振荡培养，每隔24 h测定其酸度，直至酸度不再上升或下降，结束醋酸发酵。
1.7.4膜过滤除菌
将发酵好的苹果醋用过滤网粗过滤，除去较大的固体杂质。把经粗过滤的苹果醋倒人管式膜料液桶中在进料温度26℃、操作压力0.1 M Pa条件下超滤，除去苹果醋发酵液中的菌体，使醋质澄清。
1.7.5苹果醋饮料调味
以过滤好的澄清苹果醋为基料，加入苹果汁、蜂蜜、蔗糖和黄原胶等配成果醋饮料。再通过10个人对各种配比调出的口味评分得到最佳苹果醋饮料配方。
2结果与分析
2.1酒精发酵
酒精发酵就是将苹果汁中的糖类物质在无氧条件下，受到酵母菌酒化酶的作用，生成酒精的全过程。酒精发酵过程中的酒度变化，检测结果如图1。
由图l可知前48 h处于酒精发酵前期，由于苹果汁中有少量的溶解氧和营养物，酵母菌迅速繁殖，酒精发酵作用不强，酒精和二氧化碳产生比较少；酒精发酵60～96 h进入主发酵期，发酵醪中氧气消耗殆尽，此阶段酵母菌停止繁殖主要进行酒精发酵，酒精含量迅速上升。由于发酵强烈醪液温度上升较快，应加强温度控制，避免温度过高致使酵母菌过早衰亡；第5天发酵到达后期，糖分大部分被消耗，酒精发酵变慢，另外高浓度的酒精对酿酒酵母的生长发酵活动有抑制作用，因此，酒精度不再上升发酵终止，最终得到酒精度为6.07%vol的苹果酒。
2.2醋酸发酵条件优化
醋酸发酵过程中需要维持菌体生长和发酵的适宜环境条件，利用正交试验和极差分析法对影响食醋液态发酵过程中产酸量（以酸度计，总酸减去初始底酸）的因素进行分析，包括A接种量、B酒精添加量（以酒精度计）、C初始底酸量（以酸度计）。L9(34)正交试验各因素水平见表1，除去底酸后的产酸量试验结果如表2。
由表2可知，以产酸量为评价指标，各因素对醋酸发酵过程的影响强度依次为接种量>酒精添加量>初始底酸量，直观分析表明产酸量最高的组合是A2B3C2，即接种量为1%，初始底酸量为2%，初始酒精度为5%vol。
2.3苹果醋饮料的调味试验
经膜过滤除菌、澄清后的苹果醋要选择合适的甜味剂和酸味剂，初步调配出酸甜适口的苹果醋饮料，并初步确定各种调味剂的用量范围，然后用L18(36)正交试验优化调味配方，表3为总因素水平表，表4为感官品质综合评分标准，表5为正交试验结果表。
从正交试验结果来看，对配方影响程度依次为蜂蜜>苹果醋量>有机酸>黄原胶>蔗糖>苹果汁，最佳配方为蜂蜜4%，苹果醋4%，有机酸0.09%，黄原胶0.4%，蔗糖7%和苹果汁16%，这样的配方调出的果醋口感酸甜，更符合消费大众的需求。
3结论
对苹果醋酸发酵过程的正交试验表明，接种量和初始酒精度对醋酸发酵过程影响显著，初始底酸量影响不显著，其影响强度依次为接种量>初始酒精度>初始底酸量，最佳组合为接种量1%，初始底酸量2%，初始酒精度5%vol。
对超滤除菌后的苹果醋调味正交试验表明调味苹果醋饮料用蜂蜜4%，苹果醋4%，有机酸0.09%，黄原胶0.4%，蔗糖7%和苹果汁16%调出的苹果醋饮料口感最佳。
