刘娟，田童童，童军茂，张建*
石河子大学食品学院（石河子832000）
摘要以白斑狗鱼为研究对象，提取肌浆蛋白和肌原纤维蛋白，通过三种氧化系统(Fe-H2O2-Asc氧化系统、亚油酸脂肪氧化系统和氧化酶氧化系统)，对蛋白质进行不同程度的体外模拟氧化，发现两种蛋白质对Fe-H2O2-Asc氧化系统敏感。在Fe-H2O2-Asc氧化系统中，羰基含量和表面疏水性随着H2O2浓度和氧化时间的增加而增加；且氧化时间越长，表面疏水性增加越明显；总巯基含量和游离氨含量随着H2O2浓度和氧化时间的增加而下降，且游离氨基在氧化5h时变化更显著。由此可见，氧化可以改变鱼肉蛋白的理化性质，可能会进一步导致其结构和功能性质的改变。
关键词 白斑狗鱼：肌浆蛋白；肌原纤维蛋白；蛋白质氧化：理化性质
白斑狗鱼（Esox lucius）隶属辐鳍鱼纲( Actinopterygii)，鲑形目(Salmoniformes)，狗
鱼科( Esocidae)，狗鱼属（Esox），主要分布于欧洲、亚洲和北美洲，在我国仅分布于新疆阿勒泰地区的额尔齐斯河流域以及附属水体，是新疆主要的土著经济鱼类之。我国目前对于白斑狗鱼的研究主要集中在人工养殖方面。白斑狗鱼具有丰富的营养价值，韩小丽等对白斑狗鱼的营养价值进行了研究，研究发现白斑狗鱼的含肉率高于罗非鱼、团头鲂、淡水白鲳等养殖鱼类，是一种含肉率较高的鱼；其中钙跟磷的含量也比较丰富。有研究表明白斑狗鱼中含有18种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸。
许多研究表明，引起食物腐败变质的主要原因是脂质氧化、微生物以及酶的作用，由于后两者的作用显著而导致蛋白质氧化所引起的食物品质下降被忽略。但是Marianne N．Lund等的研究发现了蛋白质氧化也是引起食物腐败变质的重要原因，它会引起蛋白质营养缺失，结构改变以及功能性质下降等现象。目前对于蛋白质氧化的研究主要集中在两方面，一方面是氧化所引起的理化性质的变化，另一方面是氧化引起的功能性质的变化。如对畜禽肉中的肌肉蛋白进行研究，发现蛋白质氧化会引起肌肉蛋白质中羰基、游离氨、表面疏水性等方面的变化；对乳中β-乳球蛋白的氧化研究发现，氧化会引起蛋白质发生凝聚现象等。
试验以白斑狗鱼肌肉中的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白为研究对象，通过三种氧化系统（羟基自由基氧化系统、亚油酸脂肪氧化系统和氧化酶氧化系统）对肌肉蛋白质进行氧化，分析氧化对白斑狗鱼肌肉蛋白理化性质的影响，为白斑狗鱼流通及生产中通过抑制或适当控制氧化，提高蛋白质功能性提供依据。
1 材料与方法
1.1材料、试剂与仪器
白斑狗鱼，市售，重1.5 kg，体长约32 cm。
磷酸氢二钠(Na2HPO4)；磷酸二氢钠( NaH2PO4)；氯化钠(Na Cl)；氯化铁；抗坏血酸；过氧化氢；脂肪氧化酶；亚油酸；过氧化物酶；乙二胺四乙酸( EDTA)；2，4-二硝基苯肼( DNPH)；乙酸乙酯；乙醇；盐酸胍；Tris；甘氨酸；尿素；Ellman试剂；OPA; SDS;硼砂；β-巯基
乙醇等。紫外可见分光光度计。
1.2试验方法
1.2.1样品的制备
1.2.1.1鱼肉样品制备
将鲜活鱼击晕致死，去头、鳞和内脏，清洗干净后剔除鱼骨，将背部肌肉分割成大小均匀的小块，置于冰箱中备用。
1.2.1.2蛋白样品的制备
白斑狗鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的蛋白提取参考Hashimoto和Chine的方法，提取液分别为磷酸盐缓冲液A( 50 m mol/L Na2HPO4，50 m mol/L NaH2PO4，pH 7.5)和磷酸盐缓冲液B(50 m mol/L Na2HPO4，50m mo/L NaH2PO4，0.6 mol/L Na Cl，pH 7.5)所提取的蛋白用于测定蛋白质氧化后的理化性质的变化，操作方法为：
加入10倍体积的磷酸缓冲液B（均质1 min，4℃．8 000 r/min离心15 min），重复操作2次。
1.2.1.3蛋白含量的测定
采用Biuret法测定蛋白质的含量，标准曲线如图1。
1.2.2氧化系统的制备及反应
制备三种可以产生活性氧自由基( ROS)的氧化模拟系统。
1.2.2.1 Fe/H2O2/A sc氧化系统
该系统主要由FeCl3、A sc和H202通过铁的氧化还原反应而产生自由基。也可称为羟基自由基氧化系统( HRGS)。试验主要采用过氧化氢氧化体系，即固定体系中的氯化铁和抗坏血酸的浓度，改变过氧化氢的浓度：0，1，5，10，15和20 m mol/L。
1.2.2.2亚油酸脂肪氧化系统
用不同活性的脂肪氧化酶(5 000，8 000，10 000，15000和20 000U)将亚油酸（100 mol/L）进行氧化。
1.2.2.3 氧化酶氧化系统
通过控制过氧化氢的浓度(50，80，100，120和150 mo/L)激活过氧化物酶(100 mo/L)。
1.2.2.4 白斑狗鱼肌肉蛋白的氧化反应
将提取的蛋白样品分别溶解在含有三种氧化体系的磷酸缓冲溶液( 50 m mol/L、pH 6.0)中，然后将样品在4℃条件下分别放置1，3，5h，使白斑狗鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白发生不同程度的氧化，反应结束时加入EDTA终止氧化反应。
1.2.3理化指标的测定方法
羰基含量和表面疏水性测定参考李艳青报道的方法进行测定；总巯基含量参考Simplicio等报道的方法进行测定；游离氨含量根据Brands等报道的方法进行测定。
1.2.3.1羰基含量的测定
取1m L的样品溶液放人离心管中，每管中加入l m L 10 m mol的2，4-二硝基苯肼(DNPH)，室温下反应1 h（每10 min旋涡振荡一次）后，添加1 m L 20%TCA，8 000 r/min离心5 min，弃清液，用1 m L乙酸乙酯：乙醇(1：1)清洗沉淀3次除去未反应的试剂，加3 m L 6 mol/L盐酸胍溶液后置于37℃条件下水浴保温15 min溶解沉淀，再将反应液8 000 r/min离心5 min
除去不溶物质，所得沉淀在370 nm处测吸光度。使用分子吸光系数22 000 11( mol．cm)计算羰基含量，羰基含量表示为nm oL/mg蛋白；蛋白含量用双缩脲法测定，用血清白蛋白做标准曲线。
1.2.3.2总巯基含量的测定
取1mL的样品溶液，加入8 m L的Tris-甘氨酸（pH 8，每升该溶液中含有10.4 g Tris，6.9 g甘氨酸，1.2 g EDTA，8 mol/L尿素），然后经均质和10 000 r／min离心15 min，除去不溶蛋白。将样品溶液加入0.5m L 10 m mol/L Ellm an试剂，30 min后在412 nm处测定吸光度，巯基浓度计算使用分子吸光系数13 600 11( mol．cm)，蛋白含量使用双缩脲法测定。对照组
不加蛋白溶液，其它处理方法相同。
1.2.3.3游离氨基的测定
采用OPA法对蛋白中游离氨基进行测定。准确称取40 mg的OPA溶解于1 m L的甲醇中，分别加入质量分数20%的SDS 2.5 m L．0.1 moI/L的硼砂25 m L及100μ Lβ-巯基乙醇，最后用蒸馏水定容到50 m L。测定时，各取空白液、OPA试剂4 m L于试管中，分别注入200
ILL样品液，混匀后于35 0C反应2 min，在340 nm下测其吸光度A340nm，二者之差△A340nm为自由氨基的净吸光度。以未氧化的蛋白中自由氨基含量为100%，其余氧化蛋白的吸光度与未氧化蛋白中的自由氨基吸光度相比所占百分比为游离氨的相对含量，利用相对含量进行作图。
1.2.3.4表面疏水性的测定
取1 m L的样品溶液加入200 p4L的溴酚蓝(BPB，1 mg/m L)，混匀，室温下搅拌10 min，然后8 000 r／min离心15 min，上清液（稀释10倍后）在595 nm下测定吸收值A。溴酚蓝空白样是用1mL 20 m mol/m L的磷酸盐缓冲液( pH 6.0)加200 p4L BPB，磷酸盐缓冲液作空白样。
1.2.4数据分析
用Origin和SAS软件进行数据处理和差异显著性分析(p<0.05)，所有处理重复3次。
2结果与分析
2.1 氧化对白斑狗鱼肌肉蛋白羰基含量的影响
目前蛋白质羰基化是研究蛋白质氧化最常用的生物标记，因此把羰基值作为衡量蛋白质氧化程度的一个重要指标，即羰基含量的多少反映了蛋白质氧化程度的高低。羰基的产生途径有以下4种：(1)氨基酸侧链的直接氧化；(2)肽骨架的断裂；(3)与还原糖发生反应；(4)结合非蛋白羰基化合物。在蛋白质氧化的过程中，氨基酸侧链上的-NH或者是-NH2被羟自由基(．OH)氧化，转化成羰基基团。
图2为不同氧化系统对白斑狗鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白羰基含量的影响。由图可知，样品在经过三种氧化系统的处理后，羰基含量均出现了不同程度的增加；在相同的氧化体系中，羰基的含量与氧化时间成正比。通过图2中的A1和A2可以发现，相同的氧化时间里，随着H2O2浓度的增加蛋白质羰基的含量整体成上升的趋势，如在氧化3h的条件下，空白对
照组中肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的羰基含量分别为5.73 n mol/mg蛋白和7.16 n mol/mg蛋白，当H2O2浓度达到10 m mol/L时，羰基的含量分别增加到了7.35 n mol/mg蛋白和9.05 n mol/mg蛋白，即分别增加了28.27%和26.39%；羰基含量的增加可能是由于H2O2中的羟自由基(．OH)的不断的增加，而羟自由基(．OH)与氨基酸侧链或肽链不断的发生氧化反应造成羰基含量的增加；在相同的浓度条件下，羰基含量随着氧化时间的增加而增加如在H2O2浓度为5 m mol/L的条件下，肌浆蛋白氧化5h后，蛋白质羰基含量与氧化1 h相比增加了1.08倍；肌原纤维蛋白氧化5h后，其羰基含量与氧化1h相比则增加了1.07倍。但是通过图2可知，在三种氧化系统中，铁-过氧化氢-抗坏血酸氧化系统中的羰基含量(p<0.05)明显高于其他两个氧化系统，说明白斑狗鱼肌肉浆蛋白和肌原纤维蛋白对铁-过氧化氢-抗坏血酸氧化系统敏感。因此，试验的后续选用铁-过氧化氢-抗坏血酸氧化系统进行研究
2.2氧化对白斑狗鱼肌肉蛋白总巯基含量的影响
巯基（-SH）具有很高的抗氧化活性，是蛋白质中一个重要的功能基团。蛋白质氧化可以使巯基转化成二硫键，而蛋白质的凝胶、成膜特性以及蛋白质结构的稳定性等又都与巯基（-SH）与二硫键（-S-S-）间的转化有关，因此巯基的含量可以反映蛋白质氧化的程度。
图3为铁-过氧化氢-抗坏血酸氧化系统对白斑狗鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白总巯基含量的影响，由图可知，总巯基的含量与氧化时间成反比，即随着氧化时间的延长总巯基的含量整体呈下降趋势，如在10m mol/L H2O2条件下，分别经过1，3和5h的氧化后，肌原纤维蛋白总巯基的含量减少了42.59%．50.03%和50.09%，肌浆蛋白总巯基的含量减少了30.26%，42.45 %和51.87%；相同的氧化时间里，蛋白质总巯基的含量随着H2O2浓度的增加而降低，如肌浆蛋白和肌原纤维蛋白在氧化5h的条件下，分别经过1，5，10，15和20 m mol/L H2O2氧化后，当H2O2浓度增加到20 m mol/L时，总巯基含量降低了58.89%和67.49%。但是在高
浓度的过氧化氢条件下，总巯基的含量不再明显下降，降速缓慢，推测可能是因为氧化剂度较高时氧化系统中氧化达到了平衡，从而使总巯基趋于恒定。
2.3氧化对白斑狗鱼肌肉蛋白游离氨基含量的影响
图4为铁-过氧化氢-抗坏血酸氧化系统对白斑狗鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白游离氨基含量的影响，由图可知，游离氨基含量趋势与总巯基含量趋势一致，都呈下降趋势。即游离氨基含量与H2O2浓度、氧化时间呈反比。在相同的氧化时间内，游离氨基的含量随着H2O2浓度的增加而降低，如白斑狗鱼肌原纤维蛋白在氧化5 h的条件下，经过1，5，10，15和20 m mol/LH，0，氧化后，游离氨基的相对含量由最初的100%分别减少到81.40%，71.46%，64.48%．62.75 %和57.38%，而肌浆蛋白经过5h的氧化后，当H2O2浓度从1 m mol/L增加到10 m mol/L时，游离氨基的相对含量减少了15.91%；在相同H2O2浓度条件下，游离氨基的含量随着氧化时间的延长而降低，如在10mmol/L H2O2条件下，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白经过5h氧化后的游离氨基相对含量同经过1 h和3h氧化后的游离氨基相对含量相比较下降更为迅速。游离氨基含量的下降可能是由于侧链中含有-NH或者是-NH2的氨基酸参与了羰基的形成。
2.4氧化对白斑狗鱼肌肉蛋白表面疏水性的影响
蛋白质结构的稳定在很大程度上有赖于分子内的疏水作用，一般都把疏水性作为评价蛋白质变性的一个重要参数。蛋白质的变性程度可以用蛋白质表面疏水性来衡量，表面疏水性增加则表示蛋白质的变性程度增加。
图5为铁-过氧化氢-抗坏血酸氧化系统对白斑狗鱼肌浆蛋白和肌原纤维蛋白表面疏水性的影响，由图可知，肌原纤维蛋白与溴酚蓝的结合量远高于肌浆蛋白；在整个氧化过程中蛋白质的表面疏水性随着H2O2浓度的增加而增加，如在氧化3h的条件下，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白在经过0，1，5，10，15和20 m mol/LH2O2氧化后，溴酚蓝的结合量分别从55.35 μg和77.45μg最终增加到了87.18 μg和104.04 μg，即氧化后的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白表面疏水性值与未氧化的时候相比分别增加了57.51%和34.33%；随着氧化时间的延长，表面疏水性也在不断的增加，如在10 m mol/LH2O2条件下，肌浆蛋白在经历1h和3h氧化时表面疏水性值变化不大，但是在经过5h的氧化后，表面疏水性值显著上升，而在5 m mol/L H2O2条件下，肌原纤维蛋白在经历5h的氧化后，表面疏水性值同氧化1 h和3 h相比明显增加。出现这一现象的原因，可能是因为氧化使蛋白质分子中的某些疏水性基团暴露，从而增加了蛋白质表面的疏水性。
3结论
通过研究发现，白斑狗鱼肌肉蛋白对FeCl3-H2O2-A sc产生的羟自由基氧化系统更为敏感。氧化改变了肌肉蛋白的理化性质，如羰基含量和表面疏水性随着H2O2浓度和氧化时间的增加而增加；总巯基含量和游离氨含量随着H2O2浓度和氧化时间的增加而呈现下降的趋势。另外蛋白质的理化性质与其功能性质、营养价值等方面都有一定的联系，因此，在白斑狗鱼运输、贮藏及加工过程中应尽量控制鱼肉蛋白氧化的发生，保证鱼肉的营养价值和食用价值。
