大孔树脂分离纯化紫甘蓝中的花色苷

 任萍*，袁晓雨，赵晓萌，徐慧娟，肖立伟，王东升

 廊坊师范学院（廊坊065000）

摘要采用大孔吸附树脂法纯化紫甘蓝中的花色苷，考察不同极性树脂对花色苷的静态吸附性能及动态吸附性能和纯化效果的影响，确定紫甘蓝花色苷的纯化工艺条件。研究发现HPD 500树脂对花色苷的吸附选择性最好。以色价为标准，同时考虑到吸附率和解吸率，确定了HPD 500树脂对紫甘蓝中花色苷的纯化工艺条件。结果表明，HPD 500树脂纯化花色苷的最佳条件为：上柱液pH 2.5，上柱液吸光度0.707，上柱液体积1.5 BV，吸附流速1.5 BV/h，洗脱流速1.5 BV/h，解吸液为质量分数60%的酸性乙醇(pH 2.5)。最佳条件下得紫甘蓝花色苷色价为47.8，提高为初始值(2.3)的20.8倍。

关键词  大孔吸附树脂；紫甘蓝；花色苷；纯化

  食品加工过程中经常涉及食品的染色，会经常使用一种食品添加剂——食用色素。近些年来随着医学、毒理学和生物学研究工作的不断深入，在食品工业中大量使用的合成色素被认为对人体有害，有的甚至致癌。因而世界卫生组织及各国开始禁用一些合成色素，例如苋菜红等，这些禁令促进了人们对于天然色素的研究。

  花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类天然水溶性色素，主要存在于花卉、果实及有色叶片中，使其呈现由红、紫红到蓝等不同颜色。研究表明，花色苷类化合物具有显著的生理活性：例如抗自由基、改善视力、预防心血管疾病、提高认知能力、抗肿瘤和抗突变等。但是大部分天然色素从植物中提取出来会含有很多的杂质，这会影响到天然色素的稳定性和染色力，因此需要对天然色素进行纯化。大孔吸附树脂是近十几年发展起来的一种新型高分子吸附剂；目前，大孔吸附树脂主要应用于环保、医药工业、化学工业、分析化学和临床鉴定等多个领域，广泛应用于天然产物有效成分的分离纯化研究。紫甘蓝属十字花科芸薹属，又名紫卷心菜，也叫紫圆白菜，它作为一种食用性蔬菜在我国已大面积种植。从紫甘蓝菜中提取得到的色素，属于蔬菜花色素苷类物质，色泽鲜艳，使用安全无毒，是一种新型的天然色素。文献中利用大孔树脂纯化其它植物中色素的研究较多，但目前对紫甘蓝中花色苷的研究多为其提取工艺及其性质研究，或大孔树脂对紫甘蓝花色苷吸附及解吸性能的研究，利用大孔吸附树脂对紫甘蓝花色苷纯化的研究较少，J．Chandrasekhar和贺菊萍等利用大孔树脂纯化紫甘蓝色素，重点研究了树脂与紫甘蓝色素的吸附、洗脱条件，主要以吸附和解吸率作为评价标准，并没有以花色苷纯度或者花色苷的色价作为评价纯化效果的标准。

 试验以紫甘蓝为原料，研究不同极性大孔吸附树脂对紫甘蓝中花色苷的吸附解吸性能，以纯化后花色苷的色价为标准，探讨纯化工艺参数，找到适合纯化紫甘蓝色素的最佳树脂，得到具有高纯度、高色价的紫甘蓝色素提取物，为紫甘蓝花色苷纯化及利用提供理论依据，同时也将对扩大天然食用色素品种和综合利用农产资源具有实际意义和经济效益。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

  新鲜紫甘蓝：河北廊坊。

  不同极性大孔吸附树脂：如表1所示，河北省沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

 冰乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、无水乙醇，均为分析纯。

1.2仪器与设备

  TU-1201紫外可见分光光度计：北京大华辰光电子有限公司；pHS-2F pH计：上海右-仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；TH2-82A水浴恒温振荡器：金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1  紫甘蓝花色苷粗提液的制备

 将新鲜紫甘蓝洗净切碎后，以质量分数60%酸性乙醇（用醋酸调节，pH 2.5）做提取溶剂，料液比为1：10( g/m L)，35℃下浸提4h后抽滤，得花色苷粗提液。

1.3.2花色苷粗提液的浓缩

 取一定量花色苷粗提液置于旋转蒸发仪中，35℃下将花色苷粗提液浓缩，再将浓缩液置于真空干燥箱中，35℃下将浓缩液烘干成花色苷粗提物。

1.3.3花色苷提取液吸收光谱的测定

 用pH 2.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液将一定量花色苷粗提物配制成溶液，在400～800 nm范围内对其进行波长扫描，得到pH 2.5时花色苷的可见光吸收光谱图，得出此条件下的最大吸收波长。

1.3.4大孔吸附树脂的预处理

 用乙醇作为溶剂，将一系列不同极性的树脂，利用索氏提取器进行抽提8h。晾干后用蒸馏水洗至无醇，滤出树脂，用水浸泡待用。

1.3.5大孔吸附树脂对花色苷的静态吸附

 精确称取处理好的湿树脂( HPD 100，HPD400, HPD 500, HPD 600, HPD 826和ADS 17)各1

 g，分别置于锥形瓶中加入吸光度为0.880的花色苷样品液30 m L，具塞，置于恒温振荡器上于25℃，120 r／min振荡至吸附平衡，测定吸附后溶液吸光度。将吸附后的树脂滤出，加入30mL 60%酸性乙醇（用醋酸调节，pH 2.5），具塞，置于恒温振荡器上于25 ℃，120 r/min振荡至解吸平衡时间以上，测定解吸液吸光度。并根据式(1)和(2)计算出吸附率、解吸率。

 式中：A0、A1和A2分别为吸附前、吸附后和解吸液的吸光度；V0、V1和V2分别为吸附前、吸附后和解吸液的体积，m L。

1 .3.6大孔吸附树脂对花色苷的动态吸附

1.3.6.1  色价与吸附率、解吸率的测定

 色价是单位质量原料的提取物在1 g/L质量浓度、以1cm比色皿在其最大吸收峰处的吸光度。精确称取花色苷提取物，溶于蒸馏水中，调节pH 2.5，在最大吸收波长下测定其吸光度，根据式(3)测定色价。

  式中：A为实测试样的吸光度；伪稀释倍数； m为试样质量，g。

 动态吸附率与解吸率计算与1.3.5静态吸附率、解吸率计算一致。

1.3.6.2动态吸附溶液的制备

 将1.3.2得到的花色苷粗提物，用适量蒸馏水溶解，用冰乙酸调节pH 2.5，测定花色苷溶液的吸光度，作为动态吸附的上柱液。

1.3.6.3  动态吸附过程

 分别量取湿树脂HPD 100，HPD 400，HPD500, HPD 600和HPD 826各20 m L装层析柱(长径比20：1)。各取40 m L吸附溶液上柱，以40 BV/h的吸附流速将吸附液通过上述五种树脂分离柱，再配制一定量用醋酸调节pH 2.5，质量分数60%的乙醇水溶液，将树脂上吸附的物质洗脱至无色，收集流出液和解吸液。测定纯化前、流出液和解吸液的吸光度，并计算出吸附率和解吸率。

 将解吸液置于真空干燥箱中，35℃下烘干至恒重，准确称其质量，并用pH 2.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，定容于50 m L容量瓶中，在最大吸收波长处测其吸光度A，计算色价。采用纯化后提取物的色价作为衡量花色苷纯化效果的指标，同时兼顾吸附率和解吸率筛选出最佳树脂。

1.3.7树脂最佳动态吸附条件的优化

1.3.7.1  吸附溶液pH对吸附的影响

 5份湿树脂HPD 500各20 m L装柱，配制pH为2.5时吸光度为0.875的花色苷水溶液，分别用醋酸调节不同的pH为2.0，2.5，3.0和3.5，上柱液体积2 BV，调节吸附流速2 BV/h，吸附完毕后用pH 2.5，质量分数60%的酸性乙醇以2 BV/h速率洗脱至无色，测定流出液和  洗脱液吸光度，计算吸附率，并将洗脱液真空35℃蒸干测定色价。

  1.3.7.2上柱液体积对花色苷纯化的影响

 5份湿树脂HPD 500各20 m L装柱，配制pH为2.5时吸光度为0.875的花色苷水溶液，上柱液体积分别为1，1.5，2，2.5和3 BV，调节吸附流速2 BV/h，吸附完毕后用pH 2.5，质量分数60%的酸性乙醇以2 BV/h速率洗脱至无色，测定流出液和洗脱液吸光度，计算吸附率。并将洗脱液于35℃真空蒸干，测定色价。

  1.3.7.3上柱液吸光度对花色苷纯化的影响

 5份湿树脂HPD 500各20 m L装柱，配制pH为2.5时 吸光度分别为0.930，0.799，0.707，0.610和0.510的花色苷水溶液，上柱液都为40 m L，调节吸附流速2 BV/h，吸附完毕后用质量分数60%酸性乙醇以2 BV/h速率洗脱至无色。动态吸附后测定流出液和洗脱液吸光度，计算吸附率。并将洗脱液于35℃真空蒸于，测定色价。

  1.3.7.4吸附流速对花色苷纯化的影响

 5份湿树脂HPD 500各20 m L装柱，取pH为2.5时吸光度为0.910的花色苷水溶液5份各40 m L上柱，调节吸附流速分别为1，1.5，2，2.5和3 BV/h，吸附完毕后用质量分数60%酸性乙醇以2 BV/h速率洗脱至流出液无色，动态吸附后测定流出液和洗脱液吸光度，计算吸附率。并将洗脱液于35℃真空蒸干，测定色价。

1.3.7.5洗脱流速对花色苷纯化的影响

 5份湿树脂HPD 500各20 m L装柱，配制吸光度为0.910的花色苷水溶液各40 m L上柱，调节吸附流速2 BV/h，用40 m L质量分数60%酸性乙醇洗脱，调节洗脱流速分别为1，1.5，2，2.5和3 BV/h，动态吸附后测定流出液和洗脱液吸光度，计算解吸率。并将洗脱液于35℃真空蒸干，测定色价。

1.3.7.6洗脱液乙醇质量分数对花色苷纯化的影响

 5份湿树脂HPD 500各20 m L装柱，取吸光度为0.815的花色苷水溶液5份各40 m L，调节吸附流速为2 BV/h，吸附后分别用质量分数为40%，50%，60%，70%和80%的酸性乙醇以2 BV/h速率洗脱至无色，测定流出液和洗脱液吸光度，计算解吸率。并将洗脱液于35℃真空蒸干，测定色价。

1.3.7.7最佳条件的验证

 在上述步骤得到树脂的最佳动态吸附条件下对花色苷粗提液进行纯化，得到花色苷洗脱液，于35℃真空蒸干，测其色价，计算吸附率和解吸率。

1.3.8数据处理

 以上试验数据均重复3次，取平均值。

2结果与分析

 花色苷在酸性条件下( pH 2～3)比较稳定，花色苷的粗提取试验都是在pH 2.5条件下进行的，如图1为pH 2.5时花色苷的全波长扫描，最大吸收波长为530nm，所以花色苷的测定波长为530 nm。

2.1  大孔吸附树脂静态吸附结果

 表2表示了室温25℃下大孔树脂对花色苷的静态吸附率及解吸率。从表中可以看出，这几种树脂对花色苷的吸附率以HPD 100最高为91.8%，HPD 400次之，为85.7%，最低的为ADS17，静态解吸率都超过60%，其中ADS17解吸最高。说明ADS17树脂对花色苷的吸附力弱，吸附容量小。但是要想研究树脂对花色苷的纯化效果，单看静态的吸附率和解吸率是不够的，所以采用动态吸附手段来研究它们纯化效果的差异，在后续试验中剔除了吸附量极小的ADS17树脂，将余下五种树脂进行动态吸附试验，引入纯化后花色苷的色价作为标准，同时考虑动态吸附率和解吸率，以优选出最佳树脂。

2.2动态吸附结果

2.2.1动态吸附树脂的筛选

 相同浓度花色苷提取液先后经历五种树脂的吸附和解吸过程。表3为不同树脂对花色苷的纯化效果，可知，HPD 500树脂可以获得较高色价的花色苷。这是因为紫甘蓝中的花色苷是具有一定极性的物质，而HPD 500树脂也是极性树脂（见表1），树脂极性与紫甘蓝花色苷的极性恰好相匹配，极性与疏水协同作用，从而提高了树脂对花色苷色素的吸附选择性。由表3还可以知道，动态吸附中HPD 100，HPD 500和HPD 600三种树脂的吸附率及解吸率都很高，HPD826对紫甘蓝花色苷的动态解吸率较低，这是由于HPD 826大孔树脂是氢键树脂（见表1），其结构上含有较多的酰胺基团，与花色苷上的酚羟基发生很强的氢键作用，导致紫甘蓝花色苷被吸附后难以全部解吸下来。以色价最为主要考虑指标，同时考虑到吸附率和解吸率，选择HPD 500树脂来探索最佳条件。

2.2.2HPD 500树脂的最佳吸附条件

2.2.2.1  吸附溶液pH对树脂吸附的影响

 吸附溶液pH对HPD 500树脂纯化花色苷效果的影响结果如图2所示。树脂HPD 500随着上柱液pH的增加吸附率先增后略减，在pH 2.5和pH 3时吸附率最高，在较强酸性条件下花色苷主要以花翁盐形式存在，不易被树脂吸附；而在酸性不太强的条件下，花色苷较多地保持了分子形态，容易被树脂吸附，同时考虑到解吸后花色苷色价在pH 2.5时最高，而且花色苷在酸性条件下比较稳定，所以选择最佳吸附溶液pH为2.5。

2.2.2.2上柱液体积对树脂吸附的影响

 上柱液体积对两种树脂纯化效果的影响结果如图3所示，树脂HPD 500上柱液体积为1.5 BV和2 BV时，色价较高。而吸附率随着上柱体积增加而减小，因为上柱液体积太大会发生泄漏，考虑到上柱液为2 BV时吸附率稍低所以选择最佳上柱体积为1.5 BV。

2.2.2.3花色苷上柱液浓度对树脂吸附的影响

 由图4可知，花色苷上柱液浓度影响树脂的吸附性能。对于定量的吸附剂而言，吸附质用量增大，意味着吸附比表面增大，吸附质在吸附剂上的分布较松散，从而吸附剂对吸附质的物理作用和化学作用加强，吸附量增加。从图中可以看出随着上柱液浓度的增加，吸附率有少量下降。从纯化效果看，溶液浓度低时得到的花色苷色价较小，随着上柱液吸光度的增大，可以得到较高色价的紫甘蓝花色苷色素。但随着上柱液吸光度继续增加，色价又有所下降。考虑到色价和吸附率的选择，上柱液最佳吸光度为0.707。

2.2.2.4吸附流速对树脂吸附的影响

 图5表示了HPD 500树脂吸附流速对色价及吸附率的影响，随着吸附流速增大，吸附率降低，可见较慢的流速有利于树脂对色素的吸附。但是从纯化效果来看比较复杂，吸附流速从小到大，色价先增加后减小再增加。流速为1.5 BV/h时，纯化后色价比较高。当吸附流速为3 BV/h时，虽然色价也较高，但是吸附率明显下降，出现了明显的泄漏现象。因此选择最佳吸附流速为1.5 BV/h。

2.2.2.5洗脱流速对树脂纯化效果的影响

  洗脱流速影响树脂的解吸性能及纯化效果。图6显示，对于树脂HPD 500，随着洗脱流速增加解吸率降低，因为流速过快，洗脱剂不能与花色苷充分作用而将其从树脂上洗脱出来。同时，洗脱流速为1.5 BV/h和2 B/Uh时，都可获得较高色价的花色苷色素，但是2 BV/h的洗脱流速解吸率偏低，所以选择最佳洗脱流速为1.5 BV/h。

2.2.2.6洗脱剂乙醇质量分数对动态吸附的影响

  图7显示，对于树脂HPD 500，洗脱液中随着乙醇质量分数的增加解吸率先增加后减小。乙醇质量分数分别为60%和70%时，紫甘蓝花色苷解吸率均较高；同时，随着乙醇质量分数的增加，纯化后花色苷色价先增加后减小，在乙醇质量分数为60%时，纯化后花色苷色价最大，纯度最高。因此从经济及纯化角度考虑，选用质量分数为60%的酸性乙醇水溶液为解吸液最佳。

2.2.2.7最佳条件下纯化结果

  根据2.2.2.1～2.2.2.6得到HPD 500树脂纯化紫甘蓝花色苷的最佳条件，如表4所示。

  根据上述条件纯化花色苷结果见表5，发现紫甘蓝粗提液经过HPD 500树脂的纯化可以将色价从初始的2.3提高到47.8，为初始值的20.8倍。

3结论与讨论

  选用六种不同极性的大孔吸附树脂对紫甘蓝花色苷的静态吸附进行考察，发现ADS17树脂吸附率较低，将剩余的五种树脂进行了对紫甘蓝花色苷的动态吸附，其中HPD 500树脂对紫甘蓝花色苷纯化效果最好。通过动态吸附最佳条件的研究表明，HPD 500纯化花色苷的最佳条件为：上柱液吸光度0.707、上柱液体积1.5 BV、吸附流速1.5 BV/h、洗脱流速1.5 BV/h以及解吸液为质量分数60%的酸性乙醇(pH 2.5)，最佳条件下得花色苷色价为47.8，纯度为原来的20.8倍；说明经HPD 500树脂纯化后，去除了大量杂质，提高了产品中花色苷类化合物的纯度。

  关于大孔树脂纯化某一类物质的传统研究是将解吸率和吸附率作为树脂的评价标准，而不考虑树脂对所吸附物质的选择性，试验主要以色价为主要参考标准同时兼顾吸附率和解吸率来评价纯化效果的标准，为紫甘蓝花色苷纯化及利用提供理论依据。

  此外，整个试验过程均采用无毒无害的试剂，适合在食品工业中应用。