陈艺煊，刘晓艳，吴德胜，林玉萍，陈濠，刘斌*
福建农林大学食品科学学院(福州350002)
摘要为了优化酶法对蛋白核小球藻破壁工艺，在单因素酶解pH、酶浓度和酶解时间对蛋白核小球藻破壁率影响的基础上，利用正交试验对这三个因素进行优化。研究结果表明，酶法的最优条件为：酶解pH 4.0，酶浓度2%，酶解时间4 h。在此条件下，蛋白核小球藻细胞破壁率可达82.25%。同时研究了酶法对蛋白核小球藻抗氧化活性的影响，研究结果表明酶法对蛋白核小球藻抗氧化活具有一定的促进作用，其对羟自由基、DPPH和超氧阴离子自由基
清除能力均优于未经纤维素酶处理的提取液，清除率分别为96.5%, 71.97%和93.68%。
关键词 纤维素酶；蛋白核小球藻；破壁；抗氧化活性
蛋白核小球藻是一种单细胞绿藻，已经被粮农组织命为绿色健康食品。由于其潜在的高生产率和高营养价值，尤其是他们富含脂质、蛋白质和多糖，引起了广泛的关注。近年来，有报道称蛋白核小球藻多糖具有抗肿瘤和免疫调节等生物活性。
然而，大部分微藻的细胞壁具有三层结构，往往比植物的细胞壁还坚固，生物活性物质难以释放同时也由此造成了生产费用的提高。目前，虽然有很多破壁技术如物理方法，化学处理和酶解等技术已经被应用，但是这些技术主要应用于微生物，很少应用于微藻，对于这些技术在微藻上的破壁条件优化以及对生物活性物质影响的研究则更少了。在某种程度上来说，高产品价值可以平衡高生产费用，因此，寻找一种高破壁率同时又能保持高产品价值具有重大的意义。
在提取前利用酶解技术对微藻进行破壁能够提高提取率和减少溶剂和能量的输入，因为酶能够辅助多糖或其他生物活性物质冲破细胞壁的阻碍而流进溶剂中，同时酶解法具有高效和操作简单的优势。酶解法已经被用于辅助提取藻多糖、蛋白等，但据了解，在利用酶解法对微藻进行破壁的条件优化以及对生物活性的影响方面的报道较少。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
蛋白核小球藻：中国科学院野生生物种质库；纤维素酶、1，1-二苯基-2 -三硝基苯肼（1，1-Diphe-nyl-2prcrylhydrazyl,DPPH）：美国Sigma-Aldrich公司；邻苯三酚、盐酸、乙醇等试剂均为国产分析醇。
1.2仪器与设备
数显三用水浴锅：HH金坛市精达仪器制造厂；可见分光光度计7200:上海精密科学仪器有限公司；生物显微镜：上海精密仪器仪表公司。
1.3方法
1.3.1蛋白核小球藻的培养
利用BG11培养基进行培养，该培养基为（每升）：1.5 g NaNO3, 0.04 g K2HPO4, 0.075 g MgSO4·7H2O,0.03 g CaCl2.2H2O，0.006 g柠檬酸，0.006 gFerric ammonlum citrate, 0.001 g EDTA-2Na, 0.02g Na2CO3, 0.05 g Na Cl, 2.86 mg H3BO3, 1.86 mgMnCl2. 4H2O, 0.22 mg, ZnSO4·7H2O, 0.08 mgCuSO4. 5H2O, 0.39 mg Na2MoO4·2H2O, 0.05和0.05mg Co(NO3)2.6H2O。于人工气候箱进行培养7d，对蛋白核小球藻进行收集，备用。
1.3.2蛋白核小球藻酶解破壁
准确称取样品2.0 g，置于250 m L锥形瓶中，在试验设计的条件下进行破壁。目前有很多评定破壁效果的方法，如通过测定蛋白质、多糖或其他成分的溶出量。但是，为了获得准确的破壁率，通过显微镜直接观察，利用血球板计数法对完整细胞进行计数。通过公式(1)计算蛋白核小球藻细胞破壁率。
式中：M0——破壁前的完整细胞个数；M--------破壁后的完整细胞数。
1.3.3单因素试验
1.3.3.1 酶解pH对破壁率的影响
固定酶浓度为2%，酶解时间为1h。酶解pH分别为2.5，4.0，6.0和8.5的条件下对蛋白核小球藻进行破壁。
1.3.3.2酶浓度对破壁率的影响
固定酶解pH为4，酶解时间1 h，酶浓度为1%，2%，3%和4%的条件下对蛋白核小球藻进行破壁。
1.3.3.3酶解时间对破壁率的影响
固定酶解pH为4，酶浓度为2%，酶解时间为1，2，3和4h的条件下对蛋白核小球藻进行破壁。
1.3.4正交试验设计
为了进一步优化酶法对蛋白核小球藻细胞的破壁条件，根据单因素结果，以破壁率为指标，对酶解pH、酶浓度和酶解时间进行三因素三水平正交试验，采用L9(34)正交表。正交试验因素水平见表1。
1.3.5抗氧化活性测定
利用优化后的条件对蛋白核小球藻进行破壁，然后在4 500×g下离心10 min，将上清液和不溶性残渣分离，取上清液进行抗氧化能力的测定，同时以除未加纤维素酶外其他条件一致的蛋白核小球藻提取液为对照，比较纤维素酶处理前后抗氧化活性的变化。
1.3.5.1羟自由基清除能力
羟自由基清除能力在Halliwell等的方法的基础上做一些修改进行测定。反应体系中含8.8 m m mol/L H2O21 m L．9 m mol/L FeSO4 1 m L，9 m mol/L水杨酸-乙醇溶液1 m L，样品溶液1 m L。最后加H2O2启动反应，37℃反应30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm下测定各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光度，以9 m mol/L FeSO41 m L，9 m mol/L水杨酸-乙醇溶液1 m L，样品溶液1 m L和1 m L蒸馏水作为样品的本底吸收值。按式(2)计算．OH清除率。
酶法破壁蛋白核小球藻对DPPH自由基的清除能力运用Shimada等的方法进行测定。即取2 m L样品溶液，加入2 m L 0.04 mg/m L DPPH溶液，混合均匀，室温放置30 min后，5 000 r/min离心10 min。取上清液于517 nm处测吸光度。样品对DPPH自由基的清除率用公式(3)计算。
1.3.5.3超氧阴离子自由基清除能力
采用邻苯三酚自氧化法测定。取50 m mo/L Tris-HCI缓冲液(pH 8.2) 2.5 m L，置25℃水浴中保温20mm，分别加入1 m L样品溶液和0.6 m L 25 m mol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5 min，加入0.5m L浓盐酸终止反应，于299 nm处测定吸光度（A1），以去离子水代替样品溶液测定吸光度A0。按式(4)计算O2-清除率。
2结果与讨论
2.1单因素试验
2.1.1酶解pH对破壁率的影响
由图1可以看出当酶解pH为4的时候蛋白核小球藻破壁率最高；随着pH的继续增大，细胞破壁率逐渐下降，这可能与纤维素酶在pH 4～5的时候酶活性最大有关。因此试验选pH 2.5，4.0，6.0作为正交试验中酶解pH的3个考察水平。
2.1.2酶浓度对破壁率的影响
由图2可以看出，当酶浓度从1%增加到2%，蛋白核小球藻的破壁率增加，然后随着酶浓度的继续增加破壁率则缓慢下降。这是因为对于给定的底物，酶解作用取决于酶浓度，但一旦超出最适浓度，一部分酶就没有机会接触到底物，此时酶浓度的增加对破壁并不起作用。因此选酶浓度1.0%，2.0%和3.0%作为正交试验中酶添加量的3个考察水平。
2.1.3酶解时间对破壁率的影响
由图3可以看出，随着酶解时间的增加，蛋白核小球藻细胞破壁率也在逐渐增加，酶解4h后破壁率可提高53%左右。但考虑到酶作用时间过长可能会对一些生物活性物质的影响，于是选取酶解时间2，3和4h做进一步的正交试验考察水平。
2.2正交试验
为了比较酶解pH、酶浓度和酶解时间3个因素对蛋白核小球藻破壁率的影响，运用正交法来确定蛋白核小球藻最佳破壁条件，试验设计及结果见表2。由正交试验R值分析可知，3个因素对蛋白核小球藻细胞破壁率的影响次序为A>C>B，即酶解pH>酶解时间>酶浓度，最优组合为A2B2C3。因此，对纤维素酶破壁的最佳条件为：酶解pH 4，酶浓度2%，酶解时间4h，破壁率最高为82.51%。进一步方差分析表明，三个因素中，酶解pH和酶解时间对蛋白核小球藻的破壁有显著的影响，见表3。
2.3蛋白核小球藻抗氧化活性
蛋白核小球藻在最优酶解条件下进行处理，并将所得的提取液与未经纤维素酶破壁的提取液进行抗氧化活性的比较，结果见图4。纤维素酶破壁提取液对羟自由基，DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为96.5%，71.97%和93.68%，而未经纤维素酶破壁提取液的抗氧化能力相对弱些，由图4可以看出纤维素酶法破壁可以在一定程度上保护提取液的抗氧化活性。对DPPH自由基的清除能力可提高大概17%。
3结论
酶法破壁主要是利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等水解酶对蛋白核小球藻细胞壁进行分解，使细胞结构破坏，从而使蛋白核小球藻细胞中的有效成分快速扩散与浸出。试验选取纤维素酶为研究对象，通过单因素和正交试验设计，研究纤维素酶对蛋白核小球藻细胞破壁的酶解时间、酶浓度和酶解pH三个因素进行考察，研究结果表明纤维素酶破壁最佳条件为：酶解时间4h，酶浓度为2%，酶解pH为4.0。在此最佳条件下，蛋白核小球藻的破壁率为82.51%，其提取液对羟自由基，DPPH和超氧阴离子自由基具有良好的清除能力，且比未经纤维素酶处理的提取液抗氧化效果好。因此利用纤维素酶对蛋白核小球藻进行破壁具有一定的优势。
