古静燕，李新胜，马超，孟晓峰，王朝川，吴茂玉
中华全国供销合作总社济南果品研究院（济南250014）
摘要从4种大孔吸附树脂中筛选出LS-46D去除金针菇粗多糖中的蛋白，分别考察了上样量、洗脱剂用量、样品液pH和洗脱流速对金针菇多糖的纯化作用。结果表明，最佳工艺上样量为1.5 BV，洗脱剂用量为2 BV，样品液pH为6.0，洗脱速度为1.5 BV，多糖纯度从22.4%提高到58.3%，表明LS-46D可用于金针菇多糖的初步纯化。
关键词 大孔吸附树脂；金针菇；粗多糖：去蛋白作用
金针菇（Flammulina velutipes）是一种食药两用真菌。多糖是金针菇中主要的功效成分，具有抗肿瘤、免疫调节、降低胆固醇、降血压、改善记忆功能、抗炎症、抗病毒、抑菌以及抗氧化等广泛的生理活性。金针菇多糖一般采用DEAE纤维素离子交换色谱联合Sephadex C系列葡聚糖凝胶进行多糖组分的精细分离，操作步骤繁杂，耗时较长，不利用工业化产生，而大孔吸附树脂作为一种广泛应用进行初步分离纯化、可重复利用介质在金针菇多糖的纯化中仍鲜见报道。
主要筛选并研究采用大孔吸附树脂去除金针菇粗多糖中蛋白，为规模化制备金针菇多糖提供试验数据支撑。
1材料和方法
1.1材料和试剂
金针菇多糖，采用超声-辅助热水提取自制；乙醇、浓硫酸、苯酚、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、考马斯亮蓝，均为分析纯；大孔吸附树脂LS-46D:陕西西安深蓝化工有限公司；大孔吸附树脂HP-600:河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司；大孔吸附树脂X-5，NKA-9:南开大学化工厂。
1.2仪器与设备
精密电子天平：瑞士METTLER；数显式电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；恒温调速摇床柜：上海智诚分析仪器制造有限公司。
1.3试验方法
1.3.1 金针菇粗多糖的制备
金针菇菇根粗粉→超微粉碎→过300～400目筛→加去离子水超声提取→心取上清液→减压浓缩至于→金针菇粗多糖
1.3.2多糖的测定及多糖保留率
采用苯酚-硫酸法测定样品中的多糖含量，以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.001 43x+0.126,R2=0.998 0。
1.3.3蛋白的测定及蛋白质去除率
采用考马斯亮蓝染色法测定样品中的蛋白含量，以牛血清白蛋白为标准品，绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.784x+0.010 5，R2=0.9970。
1.3.4树脂预处理
大孔吸附树脂预处理：无水乙醇浸泡24 h→水洗至无醇味→5% HC1浸泡4～6 h→水洗至中性-*5%Na OH浸泡4～6 h→水洗至中性，浸泡备用。
1.3.5树脂的初筛选及静态吸附试验
精密称取4种型号的大孔吸附树脂各5g加入150m L角瓶中，分别加入20 m L质量浓度1.0 mg/m L金针菇多糖溶液，恒温振荡6h，取样，抽滤，分别收集树脂和滤液，测定滤液中多糖、蛋白的含量；向树脂中加入60 m L洗脱剂，密封，振荡6h，抽滤，取滤液，测定洗脱液中多糖、蛋白的含量，可求得相应多糖、蛋白质量浓度，计算树脂的吸附率。
1.3.6树脂的动态吸附-解吸试验
1.3.6.1吸附试验
取筛选的大孔吸附树脂按常规湿法装柱(Φ20mm×203 mm)，上一定量的多糖样品溶液(流速1 m L/min)，考察树脂对多糖、蛋白的吸附率，确定最佳上样量。
1.3.6.2解吸试验
采用不同上样量，不同pH上柱液(5.0，6.0，7.0, 8.0和9.0)，不同洗脱流速和洗脱体积进行洗脱，收集流出液，每管取样测定多糖、蛋白含量，考察多糖、蛋白的解吸情况，确定最佳的上柱洗脱条件。
2结果与分析
2.1静态吸附-解析试验
2.1.1树脂筛选试验
表1结果显示，4种树脂对多糖、蛋白的吸附率、去除率相差明显，X-5、LS-46D对多糖吸附率分别为68.4%，71.25%，蛋白去除率为42.73%、43.84%，NKA-9的蛋白去除率最高为56.2%，但对多糖的吸附率仅为44.6%。根据吸附树脂极性吸附原理，树脂的极性同时树脂的孔径、比表面积均会影响树脂的吸附性能，作为非极性树脂且有较高比表面积的X-5、
LS-46D均对多糖有较好的吸附率，而HPD-600、NKA-9作为极性树脂，对多糖、蛋白的吸附作用强，损失率高。故试验选择X-5和LS-46D进行吸附速率比较。
2.1.2两种树脂X-5和LS-46D的静态动力学曲线
通过静态吸附试验筛选出X-5和LS-46D两种树脂，对其进行静态吸附动力学过程曲线，考察两种树脂对金针菇多糖的吸附速率，如图1所示。LS-46D树脂在180 min前对多糖的吸附速率增长较快，在240min即到达最大吸附量，随后吸附量随时间的延长略有下降；而X-5对多糖的吸附速率比LS-46D略低，在300 min到达最大吸附率，随后不再有明显的增加，且两种树脂达到最大吸附量后，吸附能力接近，故选择LS-46D为试验树脂。根据静态动力学曲线，两种树脂对金针菇多糖的吸附属于中速树脂，表明在动态洗脱过程中流速不能过快。
2.2树脂的动态吸附-解吸试验
2.2.1 上样量对大孔吸附树脂吸附力的影响
图2结果显示，树脂用量一定时，树脂对样品中多糖、蛋白的吸附率随着上样量的增加不断降低，即呈负相关。在上样量在1—2 BV时，多糖吸附率为50%～80%．当上样量增加为1.5 BV时，多糖吸附率降低为65.5%，而蛋白吸附率为57.3%，综合考虑选择上样量为1.5 BV。
2.2.2洗脱剂用量对大孔吸附树脂吸附力的影响
从图3可以看出，树脂对多糖、蛋白的吸附效率随着洗脱溶剂体积用量的增加趋势不同，多糖解析率先增加后降低，在洗脱体积达到2.5 BV时，达到最大洗脱效率，随后洗脱效率缓慢下降；而蛋白的洗脱率随着洗脱剂用量的增加是一个缓慢上升的过程，在2.5 BV时，到达一个相对高值，因此洗脱剂用量选2 BV。
2.2.3上样液pH对大孔吸附树脂吸附力的影响
由图4可知，树脂脱蛋白率受样品液pH的影响，酸性条件下，随着溶液pH的增大，多糖解析率缓慢升高，在pH 6.0时到达相对高值，随后pH增加，树脂对多糖的解析率降低，这可能是因为酸性越强树脂对多糖的吸附作用越强，导致多糖保留率低。因此多糖溶液的pH选在6.0。
2.2.4洗脱流速对大孔吸附树脂吸附力的影响
由吸附理论可知，洗脱流速越慢，有利于溶剂分子与树脂表面进行充分的扩散和分子交换，洗脱效率越高，但耗时也长。从图5可看出，随着洗脱剂流速提高，多糖和蛋白的解析率都呈下降趋势，洗脱效果逐渐降低。因此选择最佳洗脱流速为1.5 BV。
2.3验证试验
按照试验确定的条件，装填大孔吸附树脂柱(Φ40 mm×457 mm)，上样金针菇粗多糖50 g，蒸馏水溶解后微调pH为6.0进行洗脱纯化，收集洗脱液减压浓缩至干即得到纯化的金针菇多糖样品，计算样品处理前后多糖的含量。结果显示金针菇多糖纯度由22.4%提高到58.3%。
2.4金针菇多糖大孔吸附树脂的最佳纯化工艺
通过试验确定LS-46D纯化金针菇多糖的最佳分离工艺为：上样量1.5 BV，洗脱剂用量2 BV，洗脱速度1.5 BV，上样液pH 6.0，多糖纯度从22.4%提高到58.3%，表明LS-46D可用于金针菇多糖的初步纯化。
3结论
比较了4种大孔吸附树脂对金针菇粗多糖中蛋白的去除作用，经静态试验筛选出除蛋白效果最佳的树脂LS-46D。通过动态试验确定LS-46D清除蛋白的最佳工艺参数是：上样量1.5 BV，洗脱剂用量2 BV，洗脱速度1.5 BV，上样液pH 6.0，多糖纯度从22.4%提高到58.3%。
金针菇作为产量巨大的药食两用菌，其主要生理活性多糖受到普遍的关注，一般采用DEAE纤维素-52离子交换色谱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶色谱进行金针菇多糖的精细纯化。试验结果显示大孔吸附树脂LS-46D对金针菇多糖也有较好的纯化作用，可用于金针菇多糖的初步纯化，对金针菇多糖及其相关产品的开发具有借鉴意义。
