作者：郑晓敏
冷却肉是指宰后的胴体迅速进行冷却处理，使胴体温度在24 h内降为0℃~4℃，并在后续的加工，流通和零售过程中始终保持在该温度的鲜肉。持水性作为衡量冷却肉品质最重要的指标之一，越来越受到重视。肌肉的持水性( Water holding capacity，WHC)，是指当肌肉受到外力作用（如加压切碎磨绞加热冷冻解冻贮运或加工等）时，保持原有水分与添加水分的能力。持水性一般用汁液流失率( Driploss)来衡量。高汁液流失会引起PSE肉的发生，PSE
肉( Pale，Soft，Exudative)，即猪宰后肌肉苍白，质地松软缺乏弹性，肌肉表面渗出肉汁。猪宰后僵直期间，由于pH和钙离子的诱导使得肌原纤维收缩，使肌纤维内水分外流形成汁液流失。近年来研究发现，肌肉骨架蛋白的降解对系水力也有重要影响。骨架蛋白存在于横纹肌中，使细胞骨架与微原纤维相连，以维持细胞结构。连接蛋白是骨架蛋白的一种，主要由肌联蛋白( Titin)和伴肌动蛋白(Nebulin)组成。
肌联蛋白的分子质量约为2 800 kDa，是横纹肌中的弹性蛋白，约占肌原纤维蛋白质量的10%。Titin的N端与Z线交迭，整个分子跨越I带和A带，C端与M线交迭。Titin将粗肌丝与Z-线联结以维持肌原纤维的完整性和稳定性。
伴肌动蛋白的分子质量约为800 kDa的丝状蛋白，其在肌原纤维蛋白中的含量约为5%。Nebulin的C端部分地插入Z线，N端延伸到细肌丝的末端。其主要作用是保持肌动蛋白的正常结构。此外伴肌动蛋白可以附着在间隙纤丝的连接蛋白上，在肌原纤维中起到结构和调节作用。
肌联蛋白和伴肌动蛋白是肌原纤维完整性的重要贡献者。Offer等认为肌原纤维的完整程度会显著影响持水性。Rees等观察到宰后电刺激引起汁液流失增加的同时，SDS-PAGE电泳显示titin蛋白的降解程度增加。Farouk等研究发现，牛宰后21 d内汁液流失增加，SDS-PAGE电泳显示，宰后21 d起，有大量肌联及伴肌动蛋白降解产物生成。研究正常肉( Red，Firmand．Non-exudative；RFN)和PSE肉中肌联蛋白和伴肌动蛋白变化与持水性的关系，旨在探索影响肉持水性的内在因素。
1 材料与方法
1.1试验材料
在云南省曲靖市东恒经贸集团食品有限公司取样，选择饲养条件相同的大河乌猪。依据Wamer等的标准(PSE：L*>50，汁液流失率>5%，pH<6.0;RFN: L*=42~50, drip loss<5%，pH<6.0)确定10个RFN肉样和8个PSE肉样。并于宰后各时间点(1h，6h，24 h，2d，3d和5d)分别取样，用锡箔纸包裹后于-20℃冻藏保存，用于蛋白SDS-PAGE电泳分析。
1.2仪器与设备
HC-3018R台式高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；T25 -Basc高速匀浆机：德国IKA；BioRad PowerPac通用电泳仪电源：伯乐生命医学有限公司；BioRad小型垂直电泳系统：伯乐生命医学有限公司；凝胶扫描仪：精工爱普生公司等。
1.3测定方法
1.3.1滴水损失的测定
参照Honikel的方法于宰后24 h切取腰肋处背最长肌，切成2 cm厚的肉样，修成长5 cm，宽3 cm的肉条，用万分之一天平称重W1(g)。用铁丝钩住肉条的一端，使肌纤维垂直向下，悬挂于聚乙烯自封袋中，扎紧袋口后悬挂于冷库中，在4℃条件下吊挂24h，取出称重W (g)。
汁液流失率=（W1- W2）/W1×100% (I)
1.3.2肌原纤维蛋白提取
参照Huff-Lonergan等的方法。分别取在-20℃保存的宰后1h，3h，6h，9h，24 h，5d和7d的背最长肌肉样，剔除结缔组织和脂肪，切碎后取2g放于离心管中，然后加入20 mL冰冷的缓冲溶液(1%Triton X-100, 100 mmol/L KCl,2 mmol/L MgCI2,1 mmol/L EDTA．1 mmol/L叠氮钠，20 mmol/L K2HP04，pH 6.9)，在低温条件下用高速匀浆机最小转速3 400r/min匀浆10 s／次，共3次，2℃下11 000 r/min离心15min，弃上清再加入20 mL冰冷的缓冲溶液冲洗并离心一次。沉淀用10 mL 100 mmol/L KC1离心冲洗(3 020 g，10 min) -次，所得沉淀中加入10倍肉样（即20 mL）5 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)重悬浮，并于3 020 g离心10 min。重复冲洗两次后，加入5倍肉样（即10 mL）的5 mmol/L Tris-HCI溶液(pH8.0)重悬浮，即得到肌原纤维蛋白。立即用双缩尿法测定肌原纤维蛋白质的浓度，然后取1 mL蛋白质溶液与0.5 mL样品缓冲液(30 mmol/L Tris-HCl，3 mmol/L EDTA．3% SDS溶液，30%甘油，l mL的1%溴酚蓝，pH 8.0）混合并加入0.1 mL 2-巯基乙醇。所得样品溶液于50℃加热20 min，然后冷却至室温备用。
1.3.3肌联蛋白和伴肌动蛋白的SDS-PAGE电泳
参照Huff-Lonergan等的方法。分离胶浓度5%，制胶厚度为0.75 mm。使用Bio-rad Mini-ProteinⅡsystem，胶聚合后，从制胶板上取下转移到电极上，在电泳槽中加入电泳缓冲液，然后向胶孔中注入样品，上样量为60 μg/孔，5 mA电泳18 h，电泳过程保持低温（采
用冰浴）。
电泳结束后，取出凝胶染色（摇床上振荡染色4h，柒色液：0.1%考马斯亮蓝溶液，50%甲醇，30%乙酸，20%超纯水）并脱色（脱色液：50%甲醇．30%乙酸，20%超纯水）。脱色完全后用EPSON凝胶扫描仪扫描成像并用ImageJ软件(National Institutes of Health)分析凝胶上蛋白条带的光密度值。相对光密度：蛋白条带光密度值与参考样本（Reference sample，正常肉宰后1h样品，每次电泳时都加入60 μg/lane的参考样本）光密度值的比值，用以表示蛋白的完整度。相对光密度值越大，蛋白完整度越高，反之亦然。
1.3.4肌肉组织形态学分析
参照Gerald等的方法。于宰后1h，6h和24 h取样，每次横切约0.5—1 cm3的小块，置于10%的中性磷酸甲醛缓冲液中（pH 7.2，液体的温度同样品的温度相同）固定ld。将样品的厚度修整到0.5 cm继续放入缓冲液中，在室温条件下进一步固定。将冲洗24 h后的肌肉组织样品在酒精浓度梯度升高的情况下脱水透明，并用固体石蜡包埋。再用切片机切成4μm的切片，用苏木精一伊红染色技术染色。用Image-Pro Plus 5.1(Media cybernetics Inc.)软件测得肌束中肌细胞外空隙面积占肌束面积的百分比（图像均在5×物镜，10×目镜下采集）。
1.4数据统计分析
数值用SPSS 19.0软件进行f检验和相关性分析。
2结果与分析
2.1不同肉样的汁液流失率
如图1所示，宰后肉样汁液流失率在组间存在显著差异(p<0.05)。正常肉样组的汁液流失率比PSE肉样组低75.22%。
2.2 肌联蛋白和伴肌动蛋白的SDS-PAGE电泳结果
由图2可见，两种肉样的肌联蛋白降解规律基本一致，都是在宰后呈降解趋势，说明随着贮藏时间的延长，肌联蛋白在逐渐降解；正常肉样的肌联蛋白含量低于PSE肉样。正常肉样中，宰后1～24 h，肌联蛋白降解不显著(p>0.05)，宰后24 h，肌联蛋白开始迅速降解(p<0.05)。PSE肉样中，肌联蛋白在宰后lh—2 d降解不显著(p>0.05)；宰后2 d，肌联蛋白开始迅速降解(P<0.05)。通过相对含量定量分析可知，宰后1 h—5 d之间，正常肉样中肌联蛋白相对含
量变化为49%，PSE肉样中肌联蛋白相对含量变化为36%。
如图3所示，宰后两组肉样的伴肌动蛋白随时间的延长而逐渐降解。宰后1h—5 d，正常肉样与PSE肉样的伴肌动蛋白完整度无显著差异(p>0.05)。在正常肉样中，宰后1h—2 d伴肌动蛋白的降解不明显(p>0.05)，在宰后2—5 d之间出现明显降解(p<0.05)；在PSE样肉中，宰后1—24 h之间伴肌动蛋白的降解不明显(p>0.05)，宰后24 h出现明显降解(p<0.05)。通过相对含量定量分析可知，从宰后1h—5d，正常肉样中伴肌动蛋白相对含量变化为43%，PSE
肉样中伴肌动蛋白相对含量变化为40%。
2.3肌联蛋白和伴肌动蛋白完整度与汁液流失率的相关性
由表1可知，汁液流失率与宰后2d和Sd肌联蛋白的完整度有显著正相关性(p<0.05)。汁液流失率与宰后猪肉样品伴肌动蛋白的完整度无显著相关性(p>0.05)。
2.4肌肉组织形态学的变化
2.4.1 肌束内肌细胞间隙面积的变化
如图5所示，宰后两组肉样的肌肉细胞间隙面积都随时间的增加而增大，正常肉样的细胞间隙在宰后6—24 h之间显著增加(p<0.05)；PSE肉样的细胞间隙面积在宰后1—24 h之间迅速增加(p<0.05)；且PSE肉样的细胞间隙面积始终显著高于正常肉样。
图6~图7为宰后两种肉样的肌肉组织结构变化图。由图可知，两种肉样的宰后肌细胞间隙都随时间的推移而逐渐变大，PSE组的肌细胞间隙更大。
2.4.2细胞间隙面积与汁液流失率的相关性
如表2所示，宰后猪肉样品在宰后1，6和24 h的细胞间隙面积与汁液流失率均为极显著正相关(p<0.01)。
2.4.3细胞间隙面积与肌联蛋白及伴肌动蛋白完整度的相关性
由表3可知，宰后3d，5d的肌联蛋白完整度与宰后l h的细胞间隙面积呈显著正相关(p<0.05)，宰后2 d的肌联蛋白完整度与宰后1h的细胞间隙面积呈极显著正相关(p<0.01)。
由表4可知，宰后各时间点伴肌动蛋白的完整度与宰后1，6和24 h的细胞间隙面积均无显著相关性(p>0.05)。
3讨论
3.1肌联蛋白和伴肌动蛋白的变化与持水性的关系
宰后肌肉蛋白的降解不但与嫩度有关，还可能与肉的汁液流失有关。在肉的成熟过程中，肌原纤维的两个结构成分Titin和Nebulin发生了变化，Titin的分裂和Nebulin的片段化是肉成熟嫩化的重要因素。试验探讨它们的降解是否对肌肉的保水性能有利。试验通过SDS-PAGE电泳得出肌联蛋白，伴肌动蛋白的降解对持水力变化的影响。
试验中，随着贮藏时间的延长，肌联蛋白在逐渐降解；正常肉样的肌联蛋白含量低于PSE肉样，且在宰后第2天两种肉样的肌联蛋白完整度出现显著差异。正常肉样中，宰后1—24 h之间，肌联蛋白降解不显著(p>0.05)；宰后24 h，肌联蛋白开始迅速降解(p<0.05)。PSE肉样的肌联蛋白在宰后lh—2 d之间降解不显著(p>0.05)，宰后2 d开始，肌联蛋白开始迅速降解(p<0.05)；宰后第5天，肌联蛋白明显降解，这与Huff-Lonergan的研究基本一致。由表1可知，汁液流失率与肌联蛋白的完整度有正相关性，其中与宰后2d和Sd肌联蛋白的完整度呈显著正相关。说明肌联蛋白降解越多，持水力越大。
在成熟过程中，伴肌动蛋白极易受蛋白水解酶的作用而发生降解，肉成熟后伴肌动蛋白消失，但在各种动物肉中的滞留时间和降解速率各不同。研究发现，Nebulin在宰后发生降解，在宰后第3天开始显著降解，在宰后第7天基本完全降解。Melody等的报导发现，Nebulin在宰后5几乎已不可见。试验中，正常肉样中，宰后lh—2 d伴肌动蛋白的降解不明显(p>0.05)，在宰后2～5 d之间出现明显降解(p<0.05)。在PSE样肉中，宰后1 h—24 h伴肌动蛋白的降
解不明显(p>0.05)，宰后24 h出现明显降解(p<0.05)，与前人研究基本相符。由表1可知，宰后猪肉样品伴肌动蛋白的完整度与汁液流失无显著相关性，但基本呈正相关性，说明伴肌动蛋白的降解会提升肌肉的持水性，这与Huff-Lonergan的观点一致。
3.2肌联蛋白和伴肌动白降解，组织结构变化与持水性的关系
Schafer等认为细胞外间隙和汁液流失有较好的相关性。试验中，宰后正常肉样与PSE肉样的细胞间隙面积都随贮藏时间的延长而增大，但PSE组细胞间隙面积始终显著大于RFN组(p<0.05)；宰后细胞间隙面积与汁液流失率呈极显著正相关(p<0.05)，说明细胞间隙面积越大，汁液流失率越高。宰后3d，5d的肌联蛋白完整度与宰后1 h的细胞间隙面积呈显著正相关(p<0.05)，宰后2d的肌联蛋白完整度与宰后t h的细胞间隙面积呈极显著正相关(p<0.01)，说明肌联蛋白的降解越少，细胞间隙越大。宰后各时间点伴肌动蛋白的完整度与宰后1，6和24 h的细胞间隙面积基本呈正相关性，说明伴肌动蛋白的降解越少，细胞间隙越大。
4结论
宰后两组肉样的肌联蛋白和伴肌动蛋白都随着贮藏时间的推移而降解，宰后各个时间点肌联蛋白和伴肌动蛋白的完整度与汁液流失率均呈正相关。宰后肌联蛋白和伴肌动蛋白的完整度与细胞间隙面积率均呈正相关性，说明宰后肌联蛋白和伴肌动蛋白的降解速度和降解程度与细胞间隙面积及肉的持水性有关，正常肉样中肌联蛋白和伴肌动蛋白的降解强于PSE肉，他们的降解能延缓细胞间隙过早过大地形成，有利于提高肉的持水性。
5摘要
运用SDS-PAGE电泳技术对猪宰后正常肉与PSE肉的肌联蛋白和伴肌动蛋白的变化进行测定，并分析了它们与持水性的关系。结果显示肌联蛋白在宰后逐步降解。正常肉样中，宰后24 h肌联蛋白开始迅速降解(p<0.05)；PSE肉样的肌联蛋白在宰后2d开始迅速降解（p<0.05）。伴肌动蛋白在宰后逐步降解。正常肉样中，伴肌动蛋白在宰后2 d出现明显降解(p<0.05); PSE样肉中，伴肌动蛋白在宰后24 h出现明显降解（p<0.05）。汁液流失率与宰后肌联蛋白和伴肌动蛋白的完整度有正相关性。宰后正常肉样与PSE肉样的细胞间隙面积都随贮藏时间的延长而增大，PSE组的细胞间隙面积始终显著大于正常组（p<0.05）；汁液流失率与细胞间隙面积呈显著正相关（p<0.05）；宰后肌联蛋白和伴肌动蛋白完整度与细胞间隙面积呈正相关。结果表明宰后肌联蛋白和伴肌动蛋白降解越多，细胞间隙面积越小，汁液流失率越小，持水力越强。
