张 炬，马 勇，刘严华，崔正刚，王 峰*
（江南大学化学与材料工程学院，江南大学食品胶体与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）
摘要：采用吸附-交联的方法获得凹凸棒土固定的β-葡萄糖苷酶，酶的固载量为147 mg/g，表观酶活为87.5 U/g。固定后，酶在加入叔丁醇混合溶剂中催化合成辛基葡萄糖苷的催化效率显著提高，葡萄糖转化率提高80. 6%。在反应温度为500C，pH为6.5，葡萄糖浓度为0. 05 mol/L，V（辛醇）：V（叔丁醇）：V（水）=8：1：1的反应条件下，葡萄糖转化率可达到20. 4%，反应达到平衡的时问从自由酶催化反应的120 h缩短至72 h。反应动力学研究表明，葡萄糖对酶催化反应具有底物抑制作用，通过固定化可提高酶耐受底物抑制的最大葡萄糖浓度，增加最大反应速率。固定酶在重复使用3次后酶活下降70%。
关键词：凹凸棒土；β-葡萄糖苷酶；固定化；辛基葡萄糖苷；底物抑制
中图分类号：TQ426. 97；0629. 13 文章编号：0253 -4320(2016)06 -0132 -04
DOI:10. 16606/j.Cnki. issn 0253 - 4320, 2016. 06. 032
以辛基葡萄糖苷为代表的中长链烷基糖苷是一类性能优良的非离子表面活性剂，广泛应用于洗涤、化妆品等行业领域。通过传统化学法得到的烷基糖苷多为各种异构体和副产品的混合物，严重限制了其在医药、生物领域的应用价值。酶是一种具有区域和立体选择性的生物催化剂，酶法催化合成烷基糖苷可得到高纯度的产物。β-葡萄糖苷酶可在非水相中催化葡萄糖和不同链长的烷基醇生成各类烷基糖苷。但是，由于中长链烷基醇水溶性差，酶在有机溶剂中易失活等因素的制约，中长链烷基糖苷的产率均非常低。
酶固定化技术可以在保持酶催化高效性和专一性的基础上改善酶的稳定性。多种硅酸盐黏土具有机械强度高，热稳定性好，抗有机溶剂，生物亲和性良好，抗微生物腐蚀等特点，使用硅酸盐黏土作为酶固定化载体的研究受到了更多的关注。纳米凹凸棒土具有比表面积大，吸附能力强的特点，表面亲水基团可以富集水份，有利于水解酶维持三维结构。笔者以纳米凹凸棒土为载体，通过吸附一交联的方法固定β-葡萄糖苷酶，在水溶性有机溶剂体系中催化合成了辛基葡萄糖苷。
1 实验部分
1.1材料
纳米凹凸棒土由江苏省淮阴工学院化工学院提供；β-葡萄糖苷酶由实验室自苦杏仁中提取（酶活为109.18 U/g）；对硝基苯基-β -D -葡萄糖苷( pNPG)购自美国Sigma公司；对硝基苯酚(pNP)、考马斯亮蓝（G -250）、柠檬酸、磷酸二氢钠等试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2方法
1.2.1 凹凸棒土固定化口-葡萄糖苷酶
将50 mg凹凸棒土置于20 m L 0.8 mg/m L酶溶液（pH =5.8磷酸盐缓冲液配置）中，20℃恒温吸附2.5 h，离心分离上清液和固定酶。将固定酶置于0. 1%的戊二醛中10℃交联1h。固定酶用50 m L缓冲液洗涤30 min，共洗涤5次，在30℃真空干燥箱中干燥5h后置于4℃冰箱保存。计算上清液以及洗涤液中残留蛋白量。
1.2.2 固定酶催化合成辛基葡萄糖苷
取40 mg葡萄糖溶于0.05 m L pH 5.8的磷酸盐缓冲液中，加入0. 05 m L助溶剂和0.9 m L辛醇，再加入3U固定酶。于50℃恒温培养箱中搅拌反应5d。每隔24 h取样10μL用色谱甲醇稀释25倍，经0. 45μm膜过滤，通过高效液相色谱检测反应结果。
1.2.3 酶活力测定
将0.4 m L适当稀释的酶溶液（或者适量固定化酶）与1.6 m L 5 m mol/L对硝基苯基β-D -葡萄糖苷( pN PG)溶液混合（混合前分别于50℃水浴预热5 min），置于50℃水浴摇床震荡反应4 min，立即加入4 mμmol/L的Na2CO3终止反应。在波长为405 nm的条件下检测吸光度。以0.4 m L的蒸馏水作空白对照。根据标准曲线计算生成对硝基苯酚的量。酶活单位定义：在pH=5.8、50℃，每1 min水解生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活(1 U)。
1.2.4蛋白含量测定
以牛血清蛋白作为标准蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。
1.2.5HPLC检测
利用1525液相色谱仪（美国Waters公司生产）接反相C18柱（岛津YMC -Pack ODS -AQ ϕ250 mm×4.6 mm，5μm）进行检测，流动相v（甲醇）：v（水）=7:3，流速为0.8 m L/min，柱温为65℃。以葡萄糖作参照确定辛基糖苷生成量。
1.2.6酶促反应底物抑制动力学
底物抑制的Lineweaver -Burk速率方程：
2 结果与讨论
2.1戊二醛交联对固定化酶吸附稳定性和酶活的影响
戊二醛交联对固定化及酶的固载稳定性的影响如图1所示。
通过吸附作用将酶固定在载体上，再经一定浓度的戊二醛交联可以增强酶的固载稳定性。然而戊二醛也是蛋白质的变性剂，高浓度的戊二醛可使酶失活，纳米凹凸棒土具有高表面自由能，易于吸附蛋白质。在本研究中，以凹凸棒土为载体，在20℃，pH为5.8，初始给酶量为0.8 mg/m L时吸附2.5 h，凹凸棒土对卢一葡萄糖苷酶的固载量为158 mg/g，但是吸附稳定性不强，经50 m L缓冲液洗涤30 min，洗涤2次后30%的酶从载体脱落，如图1(b)所示。由图1(a)可知，经0.1%戊二醛交联后酶固载稳定性增强，洗脱后固载量为146 mg/g，固定酶表观酶活为自由酶酶活的79. 1%，固载效果最佳。通过吸附-交联法介孔 SiO2固载β-葡萄糖苷酶的量为132 mg/g，固定酶表观酶活为自由酶酶活的68.7%。可见，纳米凹凸棒土对β-葡萄糖苷酶具有良好的固载能力。
2.2固定酶催化合成辛基糖苷反应中助溶剂的选择
β-葡萄糖苷酶有机溶剂耐受能力较弱。多数β -葡萄糖苷酶催化合成糖苷的反应只能选择在醇／水两相体系中进行。然而，泰国红木β-葡萄糖苷酶催化合成烷基糖苷的研究中，加入助溶剂DME提高了辛基糖苷的产率，表明在反应体系中加入有助于底物互溶的有机溶剂有利于β-葡萄糖苷酶催化的糖苷化反应。
由表1可知，DMSO、DMF添加5%，自由酶完全失活，加入5%叔丁醇、乙二醇二甲醚，自由酶催化生成辛基糖苷的量显著下降。由表2可知，在加入5%极性助溶剂后，经凹凸棒土固定的p-葡萄糖苷酶均可催化生成辛基糖苷，其中加入叔丁醇、乙二醇二甲醚助溶剂时，反应速率提高的同时辛基糖苷生成量也有所上升。各种助溶剂加入量对固定酶催化反应的影响如表3所示，其中叔丁醇体积分数为10%时效果最佳，辛基糖苷的生成量为16. 98 m mol/L，转化率提高了55. 2%。
2.3水体积分数、酶用量、pH及温度对辛基糖苷生成量的影响影响
水体积分数、酶用量、pH、温度对反应的影响如图2所示。
由图2(a)可知，当反应体系中水的体积分数为10%时，辛基糖苷生成量最高。相比于自由酶催化合成辛基糖苷所需的水的体积分数有所降低，更有利逆水解反应的进行。由图2(b)可知，在不同的酶用量条件下反应最大生成量相同，当加入酶量大于3U时，反应速率不再提升，反应72 h结束，反应时间明显短于自由酶催化反应的120h，及聚丙烯酸微胶囊固定化酶催化合成辛基糖苷反应的168h。由图2(c)、图2(d)可以看出，在反应温度为50℃和pH 6.5时，酶催化合成辛基糖苷的生成量最高。
2.4葡萄糖底物抑制
葡萄糖浓度对辛基糖苷生成量和转化率的影响如图3所示。
在与底物浓度相关的催化反应中，底物浓度增加一般会有利于反应的正方向进行，然而由图3(a)可知，当葡萄糖的起始浓度高于0. 25 mol/L时，辛基糖苷最高生成量不再提升且反应时间变长。由图3(b)可以看出，葡萄糖转化率随着葡萄糖浓度的升高而降低。当葡萄糖起始浓度为0. 25 mol/L时，反应72 h结束辛基糖苷生成量为20. 82 m mol/L，助溶剂的应用比分相体系中酶催化合成辛基糖苷的催化效率提高214.5%。自由酶和固定酶的初始催化速率在高葡萄糖浓度时下降，如图4(a)所示。由图4(b)结合底物抑制的L-B公式计算表明，固定化后酶的S max和Ks,分别从自由酶的180.3、158.9 m mol/L增加到固定酶的223.4、208.6 m mol/L，说明促使反应速率反转的最大底物浓度增加，非活性底物-酶与底物复合物的亲和力下降，最大酶促反应速率V max也从自由酶的0.51 m mol/(L．h)增加到1. 37 m mol/( L. h)。因此，在酶催化合成烷基糖苷的体系中，高葡萄糖浓度除了会增加体系的黏度而不利于传质反应进行这一限制原因外，底物抑制也是限制β-葡萄糖苷酶催化合成烷基糖苷的重要原因。
2.5 固定酶重复使用性
固定酶重复使用性能如表5所示。固定酶重复使用3次后，酶活性下降70%，辛基糖苷生成量降至10. 27 m mol/L。β-葡萄糖苷酶的固定化不仅实现了酶的重复利用，而且使得酶易于从产物中分离，有利于下游处理。
2.6产物分析
辛基糖苷的液相色谱及质谱分析如图5所示。由图5(a)液相分析可知，5.1 min出峰的物质为葡萄糖，反应只生成一种新的物质，出峰时间为10.8 min。由图5(b)质谱分析可知，315.2是辛基糖苷单糖苷的特征分子离子峰，经验证新生成的物质为辛基糖苷单糖苷。
3结论
以凹凸棒土为载体，通过吸附-交联的方法得到固定化β-葡萄糖苷酶，在含叔丁醇混合溶剂中催化合成辛基糖苷的最大生产强度为17.3 mg/(L. h. U)，比自由酶提高214.5%，显示出凹凸棒土在酶法催化合成烷基糖苷中的应用潜力。
