小麦低聚肽中抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定

 刘文颖，谷瑞增，鲁军，潘兴昌，蔡木易*

 中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心(北京100015)

摘要为了考察小麦低聚肽中抗氧化肽的活性和结构，试验以谷朊粉为原料，采用两步酶解法制备出小麦低聚肽，在对其基础理化成分进行分析的基础上，测定了其总抗氧化活性。结果表明，小麦低聚肽中总蛋白质含量为98.32%±7.25%，酸溶蛋白质含量为93.71%±7.10%，脂肪含量为0.05%±0.01%、灰分含量为4.35%±0.46%、水分含量为4.28%±0.33%。小麦低聚肽的总抗氧化能力为2.3±0.1 m mol/100 g。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对小麦低聚肽进行分离纯化，收集6个主要的组分峰，利用Q-TOF质谱仪测定肽序列，鉴定出的15个肽段中，有3个肽段PY、LY和APSY的总抗氧化能力比小麦低聚肽强，分别为3.0±0.2，2.7±0.2和2.4±0.1 m mol/100 g。

关键词  小麦低聚肽；分子量分布；抗氧化肽；分离纯化；结构鉴定

 人体产生的自由基及其诱导的氧化反应与多种疾病密切相关，并可加速人体衰老。抗氧剂能有效清除自由基，延缓人体衰老和预防疾病。人工合成的抗氧化剂如BHT、BHA虽然抗氧化效果很好，但对人体有潜在的毒副作用，加上人们日益追求环保，因此，近年来寻找天然、安全的生物抗氧化剂成为国内外的研究重点。天然抗氧化活性肽因具有较强的活性和很高的安全性，而备受科研工作者的关注，已成为目前的研究热点。

 小麦低聚肽是以谷朊粉为原料，经过酶解、分离、纯化等制成的小分子肽混合物，具有多种生理活性，如抗氧化、增强免疫和缓解疲劳等。目前，国内外对小麦低聚肽的抗氧化活性缺乏深入和系统的研究，并且发挥作用的具体活性肽段的结构并不明确。试验以谷朊粉为原料，通过两步酶解法制备出小麦低聚肽，在对其基础理化成分进行分析的基础上，以反相高效液相色谱( RP-HPLC)、四极杆飞行时间串联质谱仪( Q-TOF MS)为检测手段，对小麦低聚肽中的抗氧化肽段进行分离纯化和结构鉴定，以期明确小麦低聚肽中抗氧化肽的活性及其结构，旨在为天然、安全的抗氧化保健食品的开发奠定一定的理论基础。

1  材料和方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

 谷朊粉：北京中食海氏生物技术有限公司；碱性蛋白酶、中性蛋白酶：诺维信生物技术有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法）：碧云天生物技术研究所；乙腈：美国Fisher公司，色谱纯；三氟乙酸：英国Alfa Aesar公司，分析纯。

1.1.2仪器与设备

 HH-4数显恒温水浴锅：普瑞斯机械有限公司；YG30喷雾干燥机：无锡市阳光干燥设备厂；LC-20AD型高效液相色谱仪：日本岛津公司；Q-TOF2正交加速电喷雾串联质谱仪：英国Micromass公司；SpectraMR酶标仪：美国DYNEX公司。

1.2方法

1.2.1小麦低聚肽的制备

 将谷朊粉溶解于蒸馏水中，浓度为10%→用均质机均质10 min→调节pH为8.5，温度为55 0C，以每克蛋白质2 500单位的酶量加入碱性蛋白酶，酶解2h→调节pH为7.0，温度保持45℃，以每克蛋白质2 500单位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h→升温至100 0C,灭酶10 min→6 000×g离心15 min，取上清液→用截留分子量为2×106 u的陶瓷膜过滤，取中间清液→用截留分子量为1000 u的超滤膜超滤，得到分子量小于1 000 u的滤过液→喷雾干燥，得到小麦低聚肽干粉

1.2.2小麦低聚肽的基础理化成分测定

 蛋白质含量测定采用GB/T 5009.5规定的方法，以干基计，蛋白质换算系数为6.25;酸溶蛋白质含量测定采用三氯乙酸法；脂肪含量测定采用GB/T 5009.6规定的方法；灰分含量测定采用GB/T 5009.4规定的方法；水分含量测定采用GB/T 5009.3规定的方法。

1.2.3总抗氧化能力测定

  使用总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法）。该法原理为酸性条件下抗氧化物可以还原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。试验操作步骤参考试剂盒说明书进行。

1.2.4小麦低聚肽的分离纯化

采用RP-HPLC对小麦低聚肽进行分离纯化。色谱条件为样品质量浓度：10 mg/m L;流动相A：V（水）：V（三氟乙酸）=100：0.1;流动相B：V（乙腈）：V（水）：V（三氟乙酸）=80：20：0.1;检测波长：UV 220 nm;流速：0.6 m L/min；柱温：320C；进样体积：50ILL。梯度洗脱程序：0～50 min．0~15%流动相B; 50～120 min，15%～40%流动相B：120～140 min，40%～80%流动相B；140.01 min, 0%流动相B。分管收集6个组分峰，利用氮吹仪除去乙腈、三氟乙酸等有机溶剂，真空冷冻干燥，得各组分干粉备用。

1.2.5抗氧化肽的结构鉴定

 采用Q-TOF2正交加速电喷雾串联质谱仪进行结构鉴定，质谱条件为：离子化方式：纳升电喷雾正离子；雾化气体：N2；碰撞气体：A r;源温：80℃；锥孔电压：50V; TOF加速电压：9.1 kV;  MCP检测器电压：2 150 V;毛细管电压：800 V; MS和MS/MS的质量准确度：0.1 n。首先进行一级质谱扫描，得到ESI-MS图。从ESI-MS图中选出待测离子，然后进行ESI-MS/MS分析。质谱图经Micromass的Max Ent 3转换后，由Peptide Sequencing推导出肽段序列。

1.2.6数据统计分析

 每组试验重复3次，采用Excel计算不同指标的平均值和标准偏差，所有图中误差值采用SD值。

2结果与讨论

2.1小麦低聚肽的基础理化成分

 结果显示，小麦低聚肽中总蛋白质干基含量为98.32%±7.25%，酸溶蛋白质含量为93.71%±7.10%．占总蛋白质95.31%。脂肪含量为0.05%±0.01%、灰分含量为4.35%±0.46%、水分含量为4.28%±0.33%。小麦低聚肽中蛋白质含量很高，酸溶蛋白质所占比例较大，说明小麦低聚肽的主要成分是较低分子量的肽类物质以及少量的游离氨基酸。

2.2小麦低聚肽的总抗氧化能力

 试验结果表明，小麦低聚肽的总抗氧化能力为

2.3±0.1 m mol/100 g。

2.3小麦低聚肽的分离纯化

 小麦低聚肽是由多种肽段组成的小分子肽的混合物。通过进一步研究，可找到小麦低聚肽中发挥活性的主要组分。目前，分离纯化方法主要有高效液相色谱、离子交换层析、凝胶过滤色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、超滤等。其中，RP-HPLC法是根据肽的极性大小而达到分离样品的目的，能够达到很好的分离效果，是最常用也是最有效的分离纯化方法，具有操作简便、分辨率高、重复性好和色谱过程稳定等优势。小麦低聚肽的分离色谱图如图1所示，依据峰形、峰高、峰面积和分离度四个指标，收集了6个组分峰，分别命名为1*~6*，每个组分峰里含有的可能不是单一肽段，通过质谱分析便可对肽段进行鉴定。

2.4小麦低聚肽中抗氧化肽的结构鉴定

 利用Q-TOF质谱仪对收集的6个RP-HPLC组分进行分析。Q-TOF质谱仪采用电喷雾离子源(ESI)和飞行时间质量分析器( TOF)，通过对各个组分二级质谱的碎片离子的质谱图解谱得到肽段的氨基酸序列结构。Q-TOF是蛋白测序的一种新方法，最强大的功能是能够对蛋白质进行测序，优点是样品用量少，并且能够测定肽段的序列。从小麦低聚肽的RP-HPLC组分中鉴定出的肽段结构如表1所示。这些肽段序列的分子量均在1 000 u以下，分别为二肽、三肽和四肽。

 将这些肽段合成标准品，测定其总抗氧化能力。15个肽段中，有3个肽段的总抗氧化能力比小麦低聚肽强，其中PY的总抗氧化能力最强，为3.0±0.2 m mol/100 g，其次是LY和APSY，分别为2.7±0.2 m mol/100 g和2.4±0.1 m mol/100 g。这三个抗氧化肽的C末端都是酪氨酸，推测酪氨酸可能对这些肽段的抗氧化活性起到了一定的作用。其余肽段的总抗氧化能力较弱，但这些肽段与抗氧化肽段的协同作用可能对整体小麦低聚肽的总抗氧化能力有一定的作用。

3结论

  试验以谷朊粉为原料制备小麦低聚肽，其总蛋白质含量为98.32%±7.25%，酸溶蛋白质含量为93.71%±7.10%，脂肪含量为0.05%±0.01%、灰分含量为4.35%±0.46%、水分含量为4.28%±0.33%。小麦低聚肽的总抗氧化能力为2.3±0.1 m mol/100 g。利用RP-HPLC对其进行分离纯化，收集6个主要的组分峰，利用Q-TOF质谱仪测定肽序列，鉴定出的15个肽段中，PY、LY和APSY的总抗氧化能力比小麦低聚肽强，分别为3.0±0.2，2.7±0.2和2.4±0.1 m mol/100 g，推测这些抗氧化肽C末端的酪氨酸对抗氧化活性起到了一定的作用。试验明确了小麦低聚肽的抗氧化活性，并对其含有的抗氧化肽进行了分离和结构鉴定，为小麦低聚肽作为抗氧化保健食品的开发利用提供了理论支持。