谷氨酰胺酶水解小麦蛋白工艺研究

 王建中1，冯中2，李领川2

 1．河南省食品工业科学研究所有限公司（郑州450053）；2．中州大学（郑州450044）

摘要  以溶解度、脱酰胺度为考察指标，研究蛋白质谷氨酰胺酶对小麦蛋白进行酶解改性的工艺。通过单因素及正交试验，对蛋白质谷氨酰胺酶酶解谷朊蛋白进行了工艺条件的优化。探讨蛋白质谷氨酰胺酶与谷朊蛋白质量比、酶解温度、酶解时间和酶解pH 4个工艺参数对酶解谷朊蛋白溶解度及脱酰胺度的影响，确定了蛋白质谷氨酰胺酶解改性小麦蛋白的最佳工艺条件：谷氨酰胺酶与谷朊蛋白质量比0.05：1，酶解温度450C,酶解时间26 h，酶解pH 7.3。在此酶解工艺优化条件下，谷朊蛋白溶解度为82.36%,脱酰胺度为45.76%。

关键词  小麦蛋白；蛋白质谷氨酰胺酶：酶解改性；条件优化

 小麦面筋蛋白又称小麦蛋白或谷朊蛋白，指以小麦为原料，用水洗去淀粉和其它水溶性物质后剩下的未变性的面筋粉体，它是小麦淀粉生产的副产物。目前，开拓小麦蛋白在食品和非食品领域中的应用，已成为国内外关注的热点。由于小麦蛋白含有较多的疏水性氨基酸：谷氨酰胺和天冬酰胺残基，这些氨基酸通过氢键等作用把蛋白质连接在一起，造成蛋白质凝聚、产生沉淀等，大大降低了蛋白质的溶解性，进而影响蛋白的工艺特性，如乳化性、起泡性和凝胶性等。蛋白质的去酰胺基化被认为是扩大其利用途经和提高其性能的最有前途的方法之一，因为较小程度的脱酰胺作用( 2%~6%)就能显著提高蛋白的功能特性。脱酰胺改性方法包括物理方法、化学方法、生物酶法及综合法。孔祥珍等用低浓度盐酸，50℃条件下对小麦蛋白的脱酰胺改性进行了研究。除盐酸外，磷酸也被用于蛋白质脱酰胺改性的研究。近年来，有机酸逐渐被用于蛋白质的脱酰胺改性的研究，如柠檬酸。虽然，物理化学法脱酰胺作用能较好改善蛋白质的溶解度，但因反应底物的非专一性，常常引起蛋白质肽链断裂、改变氨基酸结构以及产生异味等副作用。所以目前多采用作用条件比较温和且底物专一性强的酶法脱酰胺来达到改善小麦蛋白功能性质的目的。一些酶被用于研究和应用在蛋白质的脱酰胺

上，如蛋白酶、谷氨酰胺转胺酶(TG)和肽谷氨酰胺酶等。但TG酶容易引起蛋白质交联，从而使蛋白质不溶性增加。若其过量使用，会对食物造成凝聚等现象。肽谷氨酰胺酶只对分子量低于5 000 D a的多肽的谷氨酰胺酰残基起作用，对高分子量的多肽和蛋白不发挥作用且脱酰胺程度不高。蛋白质谷氨酰胺酶( Protein-glutaminase，PG)是近年来被广为研究的一种新型水解酶，因该酶能特异性水解植物蛋白中谷氨酰胺残基的胺酰基，底物专一性较强，且不会使蛋白质产生交联作用，在食品工业中具有十分广泛的应用前景。试验拟采用谷氨酰胺酶处理谷朊蛋白，得到去酰胺谷朊蛋白，以改善其原有功能性质，制备新型小麦改性蛋白产品。通过单因素和正交试验，分析底物浓度、酶用量、温度、酶解时间和pH等因素对谷朊蛋白溶解度和脱酰胺度的影响，以获得谷氨酰胺酶水解小麦蛋白的最佳工艺条件，为小麦蛋白的改性提供技术支持。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

 谷朊粉：蛋白质含量86.3%，水分11.3%，溶解度3.0%，乳化度8.0%；蛋白质谷氨酰胺酶glutaminase( 27.3 U/g)，均购自Sigma公司；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2仪器与设备

 TV-1901紫外一可见分光光度计、TZS-990原子吸收分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Kjeltec TM 3200全自动凯式定氮仪。

1.3方法

1.3.1谷氨酰胺酶改性小麦蛋白的工艺流程

 称取定量谷朊蛋白，边搅拌边加入盛有磷酸盐缓冲溶液( 200 m mol/L，pH 7.0)的恒温酶反应器内，形成底物浓度为1%的分散悬浊液，搅拌30 min后加入一定量的蛋白质谷氨酰胺酶进行酶解改性反应。酶解改性的温度40℃，pH 7.0，时间为15 h。酶解结束后，蛋白质酶解液用0.1 mol/L的醋酸溶液透析8h，然后将蛋白溶液真空冻干成固体粉末备用。

1.3.2蛋白质含量

 使用凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.3.3脱酰胺度测定：苯酚一次氯酸盐法

 样品酰胺氮含量的检测方法采用Conway微量弥散皿法的改进方法。准确称取0.200 0 g蛋白质，加入10m L 3 mol/L盐酸，密封于硬质玻璃烧瓶中，在120℃恒温条件下水解3h，水解完毕后取出冷却。取水解溶液做蒸馏，用4%的硼酸溶液接收释放的氨气。反应结束后用标准盐酸滴定，记录消耗的盐酸体积。脱酰胺度( DD)由脱酰胺处理后释放的酰胺基数目与原蛋白总酰胺基数目的比值来表示，按公式(1)计算：

1.3.4溶解度的检测

  采用福林酚试剂法测定脱酰胺样品pH 7.0的溶液中的溶解度。准确称取冻干样品( 10 mg)分散于10m L缓冲溶液中，缓冲液是10 m mol/L的磷酸盐缓冲溶液( pH 7.0)。分散好的蛋白溶液在20℃恒温条件下搅拌过夜，然后离心30 min(3 000 r/min)，收集上层可溶性组分。从上述收集的溶液中取1 m L用于测定蛋白质的溶解度，用牛血清白蛋白做标准曲线。

2结果与分析

2.1酶与谷朊蛋白质量比（E/S）对小麦蛋白酶解工艺的影响

 在恒温酶反应器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06, 0.08和0.1 U/m L，在40℃、pH 7.0的条件下反应15 h。结果如图1所示。

 由图1可知，随着蛋白质谷氨酰胺酶用量的增加，谷朊蛋白的脱酰胺度及溶解度逐渐增加，酶用量在0.01～0.05 U/m L之间时，脱酰胺度及溶解度增加很快，当酶用量为0.05 U/m L时，脱酰胺度及溶解度都最高，分别为43.78%和72.23%。随着酶量的继续增加脱酰胺度及溶解度增长缓慢。因此，选定酶用量为0.05U/m L的酶液为最适加酶量。

2.2酸碱度(pH)对小麦蛋白酶解工艺的影响

 在恒温酶反应器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量0.05 U/m L，调节pH分别为5，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5。在40℃、pH 7.0的条件下反应15 h。结果如图2所示。

 由图2可知，pH对谷朊蛋白酶的脱酰胺度及溶解度都有显著影响，pH为5.0～7.5时，谷朊蛋白的脱酰胺度及溶解度增长很快，当pH>7.5时，呈缓慢的降低趋势。当pH 7.0时，脱酰胺度最高，为45.97%;当pH7.5时，溶解度最高，为80.78%。因此，谷氨酰胺酶的最适pH为7.0～7.5。

2.3酶解温度对小麦蛋白酶解工艺的影响

 在恒温酶反应器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量0.05 U/m L，分别在32℃，37 ℃，39℃．43 ℃，45℃，47 ℃，49℃，53℃和55℃等恒温条件下，pH 7.3，反应15 h。结果如图3所示。

 由图3可知，随着酶解温度的增加，谷朊蛋白的脱酰胺度及溶解度都有显著变化。当温度在32℃～47℃时，谷朊蛋白的脱酰胺度及溶解度呈增长趋势，47℃以后呈缓慢的降低趋势，可能是由于高温使酶的活性受到抑制。当酶解温度在47℃～49 ℃之间，谷朊蛋白的脱酰胺度及溶解度均为最大值，分别为79.81%和44.32%。因此，谷氨酰胺酶的最适酶解温度在47℃~49℃之间。

2.4酶解时间对小麦蛋白酶解工艺的影响

  在恒温酶反应器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量0.05 U/m L，酶解时间分别为3，5，9，13，17，21, 24，26和30 h等，在48℃，pH 7.3条件下反应。结果如图4所示。

  由图4可知，随着酶解时间的增加，谷朊蛋白的脱酰胺度及溶解度都有显著变化。当酶解3～24 h时，谷朊蛋白的脱酰胺度及溶解度呈明显增长趋势，24 h以后呈缓慢的降低趋势。当酶解时间21 h时，脱酰胺度及溶解度均最高，分别为78.64%和43.68%。因此，最佳酶解时间确定为21h。

2.5正交试验设计

  根据单因素试验确定的范围，选择酶与底物比、改性温度、酸碱度( pH)和时间作为考察的4个因素，每个因素3个水平，以脱酰胺度与溶解度为考察指标，用L9(34)正交试验表安排试验，得出最佳改性条件。

 由表2进行直观分析，可以看出，谷朊蛋白溶解度的最优组合是A2B2C3D2，比较各因素的极差大小为RC>RB>RA>RD，对谷朊蛋白溶解度影响的主次顺序为CBAD;谷朊蛋白的脱酰胺度的最优组合是A2B2C3D2，比较各因素的极差大小为RD>RB>RC>RA，对脱酰胺度影响的主次顺序为DBCA。很明显，谷朊蛋白溶解度和脱酰胺度的最优组合是A2B2C3D2。

 由于A2B2C3D2组合不在试验之内，所以补加验证试验A2B2C3D2组合。按优选工艺组合A2B2C3D2试验3次，结果表明，谷朊蛋白溶解度为82.36%，脱酰胺度为45.76%，优于正交试验中的任何一个组合，故确定A2B2C3D2为最优的谷氨酰胺酶最优的水解小麦蛋白工艺条件。

3结论

 谷朊蛋白为原料，使用蛋白质谷氨酰胺酶对其进行酶解改性。以溶解度、脱酰胺度为考察指标，通过单因素及正交试验，对蛋白质谷氨酰胺酶酶解改性谷朊蛋白进行了工艺条件的优化，分别研究了蛋白质谷氨酰胺酶与谷朊蛋白质量比、酶解温度、酶解时间和酶解pH等4个工艺参数对酶解改性谷朊蛋白溶解度及脱酰胺度的影响，确定了蛋白质谷氨酰胺酶解改性小麦蛋白的最佳工艺条件：谷氨酰胺酶与谷朊蛋白质量比0.05：1，酶解温度45℃，酶解时间26 h，酶解pH7.3。在此酶解条件下，谷朊蛋白溶解度为82.36%，脱酰胺度为45.76%。