复合氨基酸钙的制备工艺研究

 胡文翠，代朋，李山，李传雯，吴正奇*

 湖北工业大学轻工学部食品与制药工程学院（武汉430068）

摘要以毛发中的角蛋白为复合氨基酸的来源，对复合氨基酸钙的合成工艺进行了初步探讨。在单因素试验的基石出上，通过正交试验研究了pH、螯合温度、螯合时间以及氨基酸与钙的配位比对螯合反应的影响，确立了最佳的反应条件：反应液pH 9，反应温度40℃,反应时间60 min,复合氨基酸与钙的配位比2：1。并用紫外光谱、红外光谱和差示热量扫描仪(DSC)鉴定了产品。

关键词  复合氨基酸；钙；螯合反应：红外光谱：DSC

 钙是人体内含量最多的矿物元素，约占体重的1.5%～2.0%，不仅参与骨骼、牙齿的构成，还对维持渗透压与酸碱平衡、心脏跳动以及神经冲动的传导等生理活动有着非常重要的作用。氨基酸螯合钙是钙离子与一个或几个氨基酸基团形成的具有环状结构的一类金属螯合物。与传统的补钙制剂（碳酸钙、磷酸钙和葡糖糖酸钙等）相比，氨基酸螯合钙具有良好的生化稳定性，易于人体吸收，利用率高，副作用小，在补钙的同时还能补充人体所必须的氨基酸。由于氨基酸螯合物价格较高，其应用受到了限制，利用动物有机废弃物制备氨基酸鳌合物不仅可以降低氨基酸鳌合物的生产成本，还可以实现动物有机废弃物的再利用。因此，试验以毛发中角蛋白水解液（提取了胱氨酸、酪氨酸和精氨酸后的母液等）为原料，采用水体系合成法，对pH、螯合温度、螯合时间以及氨基酸与钙的摩尔比四个参数进行优化，获得最佳工艺参数，以此为氨基酸螯合钙的研制和动物有机废弃物的综合利用提供借鉴。

1材料与方法

1.1材料、仪器与设备

  角蛋白水解液：湖北新生源生物工程股份有限公司提供；氢氧化钙、盐酸、氯化钙、氢氧化钙、乙醇、乙二胺四乙酸二钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验用水为超纯水。

 RE52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂：TDL-50B离心机：上海安亭科学仪器厂；DELTA 320 pH计：梅特勒仪器有限公司；98-1磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；冷冻干燥机：上海比朗制造有限公司；UV757CRT/PC紫外可见分光光度计：上海精科仪器公司；FTIR920傅里叶红外光谱仪：天津市拓普仪器有限公司；差示热重扫描仪：北京和信同通科技发展有限公司。

1.2试验方法

1.2.1水解液的脱色研究

 由于毛发水解液颜色较深，所含成分较为复杂，且颜色随不同的pH变化，有碍于螯合反应进行，故需进行脱色处理。通过脱色可除去废液中大部分杂质，如色素、高级脂肪酸和甾醇等。试验选用活性炭为脱色剂，选取活性炭用量、温度、脱色时间以及pH这四个因素，采用L9(34)正交试验，研究了活性炭脱色的最佳条件。其试验因素水平见表1。

1.2.2复合氨基酸及其螫合钙的制备工艺

1.2.2.1复合氨基酸的制备工艺

1.2.2.2复合氨基酸螯合钙的制备工艺

1.2.3螯合工艺最佳参数的确定

1.2.3.1单因素试验

 角蛋白水解液（氨基酸含量一定）中按照氨基酸与钙离子总量的摩尔比加入氢氧化钙，在不同温度、不同pH下反应一定时间以螯合率为指标，进行研究和分析。为正交试验各因素水平的选取提供有意义的取值范围。

1.2.3.2正交试验

 根据单因素试验结果，确定4因素3水平的最佳参数进行正交试验分析。正交试验设计水平表见表2。

1.2.4分析方法

1.2.4.1毛发水解液中氨基酸含量的测定

  采用日立L-8900型氨基酸自动分析仪对水解液进行氨基酸组成分析，氨基酸标准品购自日立公司；分析柱：4.6 mm ID×60 mm;分析树脂：日立专用离子交换树脂；泵1流量0.400 mL/min，泵2流量0.350 mL/mm。缓冲液与茚三酮按仪器说明配置。

1.2.4.2游离态钙含量的测定

 采用GB/T 5009.92-2003“食品中钙的测定”中的EDTA滴定法。

1.2.4.3螯合率的测定

1.2.4.4紫外光谱扫描

  取适量复合氨基酸及其螯合钙冻干粉样品，用超纯水溶解，利用紫外分光光度计测其在波长为200—400 nm下的吸光度。

1.2.4.5红外光谱定性检测

 将复合氨基酸、复合氨基酸钙分别与KBr压片，进行红外光谱测定。

1.2.4.6差示热量扫描(DSC)分析

 取适量复合氨基酸及其螯合钙冻干粉样品，利用差示热量扫描仪，在20℃~300℃（升温速率20 ℃/min)范围内进行热性能对比分析。

2试验结果与分析

2.1水解液的脱色研究

 通过4因素3水平的正交试验，研究活性炭用量、pH、温度以及时间对活性炭脱色的影响，并分析最优条件，其结果见表3。

 表3显示，脱色反应中，活性炭用量、pH、温度以及时间都是影响复合氨基酸脱色的主要因素，其4因素影响大小的排序为：活性炭用量>pH>脱色时间>反应温度。分析得出复合氨基酸脱色的最适条件是：活性炭用量8%，pH 3，脱色温度90 aC，脱色时间50min。此条件下脱色液的吸光度为0.432，比试验中最低的吸光度( 0.451)低，因此得出角蛋白水解液母液最佳的脱色条件为：活性炭用量8%，pH 3，脱色温度90℃，脱色时间50 min。

2.2复合氨基酸钙螯合反应条件的单因素分析

2.2.1配位比对螯合反应的影响

 按照不同的配位比( AA：Ca2+)向复合氨基酸液中加入氢氧化钙，于pH 8.5，50℃下螯合反应60 min。分别测定氨基酸螯合液中总钙含量和复合氨基酸螯合钙中总钙含量，并计算钙螯合率，结果见图1。

 由图1可知，在控制螯合温度、时间和pH不变的情况下，氨基酸与钙离子的配位比在2:1时，螯合率达到最大，超过这一配位比，螯合率变化曲线平缓。这是因为反应体系中钙离子与氨基酸的配位比越高，越利于螯合反应的进行，当达到氨基酸与钙离子配位比的理论值(2：1)时，氨基酸几乎完全螯合，继续添加氢氧化钙，溶液中钙离子浓度不再升高，不能继续促进螯合反应的进行，再增加氢氧化钙添加量只会带来原料损失。

2.2.2 pH对螯合反应的影响

 按混合氨基酸与钙的配位比为2:1，分别在不同pH条件下，在60℃水浴中螯合反应60 min。分别测定氨基酸螯合液中总钙含量和复合氨基酸螯合钙中总钙含量，并计算钙螯合率，结果见图2。

 由图2可知，氨基酸钙的螯合率随pH的增大而增大，当pH为8.5时取得最大值，在pH由8.5～10之间，螯合率逐渐降低。分析原因可能是在pH较高的碱性环境中，羟基与供电子基团争夺金属离子，不利于螯合反应的进行。

2.2.3螯合温度对螯合反应的影响

 按混合氨基酸与钙的配位比为2:1，用氢氧化钠和盐酸调pH为8.5，在不同温度下螯合反应60 min。分别测定氨基酸螯合液中总钙含量和复合氨基酸螯合钙中总钙含量，并计算钙螯合率，结果见图3。

 由图3可以看出，随着温度的升高，钙离子的螯合率先缓慢上升，在60℃时达到最大，所以螯合的最佳温度为60℃。温度影响溶液中钙离子的平衡状态和螯合反应的反应速率，温度升高，有利于钙离子的溶出及螯合反应，当反应体系的温度超过某一温度时，可能导致复合氨基酸螯合钙降解。

2.2.4螯合时间对螯合反应的影响

 按混合氨基酸与钙的配位比为2:1，用氢氧化钠和盐酸调pH为8.5，在60℃水浴中螯合反应不同时间。分别测定氨基酸螯合液中总钙含量和复合氨基酸螯合钙中总钙含量，并计算钙螯合率，结果见图4。

 由图4可知，随着螯合时间的延长，钙的螯合率逐渐升高，当螯合时间延长至60 min时，螯合反应达到平衡状态，此时，螯合率为63.6%，继续延长螯合时间，螯合率基本上没有变化，并且会造成能源浪费，故选择60 min为最佳螯合时间。

2.3正交优化试验

  正交试验结果的直观分析和方差分析分别如表4和表5所示。

 根据极差分析的结果，因素的影响顺序为A>D>B>C，C因素的极差最小，为3.397。因此，选择C项作为误差项，进行方差分析，得出，A因素（配体摩尔比）达到极显著水平，B因素和D因素都是显著水平，最佳组合为A2B3C1D2，即复合氨基酸与钙的配位比为2:1，反应液pH为9，反应温度为40℃，反应时间为60 min，在此条件下，螯合率为90.42%。

2.4复合氨基酸及其螯合钙的紫外光谱分析

  对一定浓度的复合氨基酸及其螯合钙溶液进行紫外扫描，扫描结果见图5。

 对比复合氨基酸和复合氨基酸螯合钙的紫外光谱图发现，在200～400 nm之间，复合氨基酸没有紫外吸收峰，而复合氨基酸螯合钙在219 nm处有明显的紫外吸收，这是由于螯合过程中相应原子的价电子有不同程度的跃迁，证明了复合氨基酸与钙之间发生了配合反应，此结果与文献报道的鳌合盐的结果相类似。综合比较可得出螯合反应结束后生成了新物质。

2.5复合氨基酸及其螯合钙的红外光谱分析

 图6是复合氨基酸及其螯合钙进行的红外光谱分析图。由图可知，a-氨基酸在2 362 cm-1处的特征吸收峰在复合氨基酸钙中已消失，与日本特许公报中介绍a-氨基酸在2 100 cm-1处有一特征峰，络合之后该峰就消失一致，说明氨基酸确实发生了配位反应；在特征区，-NH2的吸收峰由3 133 cm-1移动到了3 162cm-1，符合氮原于提供其未配位电子的概念，证明氮原子参与了配位；-COO-的吸收峰又1411 cm-1移至1 402 cm-1，也发生了红移，说明氨基酸中羧酸根离子中的氧原子与钙原子发生了络合，此外，产物在669 cm-1处有吸收峰，是O-H的面内摇摆振动峰，表明产物中有结合水。

  综上所述，说明氨基酸中的-NH2、-COOH键均参与了反应，进一步证明反应产物确实为氨基酸螯合物。

2.6差示热量扫描分析

 图7是复合氨基酸及其螯合钙的DSC曲线。复合氨基酸螯合钙的曲线上有两个吸热峰，说明存在两个能量变化过程。在137℃处有一个吸收峰，结合红外光谱分析，此处螯合物失去结晶水；在203 0C处有另一个吸收峰，并且复合氨基酸在此处也有吸收峰，说明螯合物开始融化，氨基酸分子发生分解。不同的DSC曲线说明复合氨基酸与钙确实发生了螯合反应，产生了新物质。

3结论

 试验表明，最佳的反应条件：反应液pH为9，反应温度为40℃，反应时间为60 min，复合氨基酸与钙的配位比为2:1，在此条件下，螯合率为90.42%。通过紫外光谱、红外光谱扫描和DSC进一步说明了复合氨基酸与钙确实发生了螯合反应。且样品中杂质含量少，且溶液呈弱碱性，易溶于水，这些条件都有利于人体吸收。