黄爱妮1，汪海波2，李丽1，胡小泓1，何伟1，林洪1
1．武昌工学院食品工程学院(武汉430065)；2．武汉轻工大学化学与环境工程学院（武汉430023）
摘要 以鲢鱼鱼皮为原料，在低于其变性温度下分别对鱼皮中杂蛋白和脂肪的脱除工艺进行了研究，并对鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的提取工艺参数进行了分析，测定了其热变性温度。结果表明，鲢鱼鱼皮原料中杂蛋白脱除的最佳工艺参数为以0.6 mol. L-1的Na2CO3溶液为杂蛋白脱除试剂，在25℃下处理2次，每次6 h；鱼皮原料中脂肪脱除的最佳工艺参数为：采用无水乙醚作为脱脂试剂，在料液比1：80 (g/m L)下处理16 h：鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白提取的最佳工艺条件为胃蛋白酶用量4 000 U．g-1，料液比1：50 (g/m L)，浸提时间6 h；此胶原蛋白的热变性起始温度为31.80℃，峰值温度为34.54℃。
关键词鲢鱼皮：胶原蛋白；提取
胶原蛋白是一种天然蛋白质，它具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和繁殖，使骨腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度，因其弱的抗原性和良好的生物相溶性，是生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量十分庞大的最佳生物医学材料。目前生产的胶原蛋白制品的原料主要来源是猪、牛和鸡等陆生动物的皮、骨和肌腱，但近年来疯牛病、口蹄疫等流行病的发生，使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大。因此，胶原蛋白原料的来源就成了非常重要的问题，人们开始探求更高质量和更高安全性的胶原蛋白原料。相对于陆生动物胶原蛋白，水产动物胶原蛋白特性、组成等都显著不同，并且在使用安全性方面也显示其优势。
我国是世界上最大的淡水鱼养殖国，淡水产品产量占全国水产品产量的40%以上，而湖北作为全国淡水鱼生产第一大省，2014年湖北省全年水产品总量433.3万t，连续第19年居全国第一，水产业已成为湖北省农业的一个重要支柱。鱼品在加工过程中，必然会产生大量的下脚料，如鱼皮、鱼鳞、鱼骨等，约占原料鱼质量的40%～55%．若不加以有效处理，不仅会造成环境的污染，而且会浪费大量的宝贵资源。鱼皮、鱼鳞中粗胶原蛋白约占80%，充分合理的利用废弃物鱼皮、鱼鳞提取胶原蛋白不仅可推动水产工业的发展，而且能变废为宝，减少环境污染。
鲢鱼，又名白鲢、胖头鱼、连子鱼等，属于鲤形目，为鲤科动物，产于长江、黑龙江、珠江流域，是著名的四大家鱼之一。鲢鱼主要用于加工鱼丸、鱼糜等产品，加工过程中鱼皮、鱼鳞等下脚料未得到有效利用。目前，国内外对鲢鱼加工下脚料的研究主要集中在鱼鳞的深加工，对鱼皮的研究较少。因此，以鲢鱼鱼皮为原料，在低于胶原蛋白变性温度的条件下进行酶溶性胶原蛋白的提取，研究胶原蛋白提取过程中，原料鱼皮的最佳预处理工艺参数和酶溶性胶原蛋白提取的最佳工艺条件，并对其热变性温度进行测定，旨在为鲢鱼鱼皮的加工利用提供一定的基础资料。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
鲢鱼皮：市售；胃蛋白酶：武汉市华顺生物技术有限公司；胰蛋白酶：武汉市华顺生物技术有限公司；L-羟脯氨酸标准品：Sigma公司；无水Na2CO3、氯胺T、对二甲氨基苯甲醛、Na OH、无水乙醚、乙酸等，均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
SE602F型电子分析天平：奥豪斯仪器有限公司；T6型紫外分光光度计：北京普析仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；LD5-2B型台式低速离心机：北京京立离心机有限公司；FE20型酸度计：梅特普-托利多仪器有限公司；AR-500动态流变仪：美国TA公司。
1.3方法
1.3.1 鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的制备工艺路线
1.3.1.1 工艺流程
1.3.1.2操作要点
鱼皮洗涤沥干后用一定料液比的溶剂浸泡脱除可溶性杂蛋白，分离上清液后，残渣继续用一定料液比的溶剂脱除脂肪，脱杂后的鱼皮用醋酸溶液溶解，分离残渣后加入一定浓度的酶液提取，酶解后将样品过滤，滤液在8 000 r．min-1的环境下低温离心，取上清液。将收集起来的滤液加入Na CI盐析，使Na CI终浓度达2.6 mol．L-1，盐析时间为14 h。盐析过夜后的溶液以5 000 r．min-1离心20 min，弃去上清液，沉淀以0.5mol．L-1醋酸溶解后，转入透析袋以高纯水透析，至无氯离子检出。倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后，得到胶原蛋白产品。
1.3.2鱼皮原料及提取液中羟脯氨酸含量的测定方法
胶原蛋白中的羟脯氨酸在其他蛋白中很少见，可视为胶原蛋白所特有的。因此，通过测定胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，可以间接评价胶原蛋白的提取效果。
1.3.2.1羟脯氨酸的测定方法
L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558 nm处测定吸光度并与标准比较，可定量羟脯氨酸的含量。
取4.0 m L L-1羟脯氨酸标准液于25 m L比色管中，加入2.0 m L氯胺T溶液，混匀后于室温下放置20 min。取4.0 m L水于25 m L比色管中，与标准液同步试验，可得空管。加入2.0 m L对二甲氨基苯甲醛与高氯酸按比例配制而成的显色剂，充分混匀后，迅速将比色管放人60℃水浴中加热20 min后取出比色管，用冰水冷却比色管3 min，然后在室温下放置30 min。用空白管作参比，在波长558 nm处以紫外分光光度计测定其吸光度。以标准液的吸光度为纵坐标，相对应的量为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.2.2鱼皮中羟脯氨酸提取率的计算
取1g鱼皮剪碎，放入100 m L具塞比色管中，加入30 m L硫酸溶液盖上塞子，置于恒温干燥箱中，105℃水解6h。趁热将水解产物用滤纸过滤至250 m L容量瓶中，用10 m L硫酸溶液分3次洗涤比色管或三角烧瓶和滤纸，滤干后，用10 m L水洗涤滤纸，合并上述溶液。用移液管移取10 m L该水解液至100 m L容量瓶中，加水50 m L，用氢氧化钠溶液将pH调至中性再用水定容至刻度，所得溶液为待测液。取4.0 m L处理好的待测液于25 m L比色管中，按照1.3.2.1的方法测定鱼皮原料中的羟脯氨酸含量。
鱼皮原料进行胶原蛋白提取后，按照上述方法测定提取液中的羟脯氨酸含量，按照式(1)计算羟脯氨酸提取率。
羟脯氨酸提取率=提取液中羟脯氨酸含量／鱼皮原料中羟脯氨酸的含量×100% (1)
1.3.3鲢鱼鱼皮脱杂蛋白工艺优化
分别采用Na OH、Na Cl、Na2CO3、N a Cl与Na OH联用，Na CI与Na2CO3联用进行脱杂蛋白处理。准确称取1 g干燥鱼皮，加入50 m L脱杂试剂，浸泡10 h，不定时搅拌，吸取脱杂上清液，测定其在280 nm处的吸光度和溶液中羟脯氨酸的含量，比较几种试剂对鱼皮中
杂蛋白的脱除效果和胶原蛋白的流失情况（以羟脯氨酸的溶出率为评价指标）。选择最佳的脱杂蛋白试剂，分别改变试剂浓度、处理温度、处理时间、处理次数等条件，考察各因素对鱼皮杂蛋白脱除效果的影响。
羟脯氨酸溶出率=脱杂液中羟脯氨酸含量／鱼皮原料中羟脯氨酸的含量×100% (2)
1.3.4鲢鱼鱼皮脱脂工艺优化
分别采用正丁醇、无水乙醚、正丁醇与无水乙醚联用进行脱脂处理。准确称取1g干燥鱼皮，加入80 m L脱脂试剂浸泡10h，不定时搅拌，分离并回收溶剂后，鱼皮挥干溶剂，测定脱脂前后鱼皮中脂肪含量，比较脂肪脱除率。选择最佳的脱脂试剂，分别改变脱脂时间和料液比，考察各因素对鱼皮脱脂效果的影响。
脂肪脱除率=（1-脱脂后鱼皮中脂肪含量／鱼皮原料中脂肪含量）×100% (3)
1.3.5鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的提取工艺研究
分别选择胃蛋白酶和胰蛋白酶作为水解酶，配制一定浓度的酶溶液，对鲢鱼鱼皮中的胶原蛋白进行提取，测定胶原蛋白的提取率。选择最佳水解酶，分别考察酶用量、料液比和浸提时间等因素对鱼皮中酶溶性胶原蛋白提取效果的影响，在单因素试验的基础上，选择酶用量、料液比和浸提时间进行三因素三水平正交试验。
1.3.6鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的热变性温度测定
用去离子水配制0.6%浓度的酶溶性胶原蛋白水溶液，用AR-500动态流变仪分析温度对胶原蛋白影响的趋势，测定胶原蛋白的热变性温度。
2结果与分析
2.1 鱼皮原料及提取液中羟脯氨酸含量测定的标准曲线
通过比色法，用空白作参照，在波长为558 nm处以紫外分光光度计测定出胶原蛋白中特有的羟脯氨酸含量的方法，来间接评价胶原蛋白的提取效果。用1.3.2的方法，绘制出羟脯氨酸含量的标准曲线如图1所示。
2.2鲢鱼鱼皮脱杂蛋白工艺及参数优化
2.2.1试剂种类对脱杂蛋白效果的影响
除了胶原蛋白以外，鱼皮中还含有部分其他种类的杂蛋白成分，必须在提取胶原蛋白之前予以去除，这样可以有效提高胶原蛋白产品的纯度。分别采用Na OH、N aCl、Na2CO6、Na Cl与Na OH联用，Na Cl与Na2CO6联用进行脱杂蛋白处理，以脱杂上清液在280nm处的吸光度和上清液中羟脯氨酸的溶出量为考察指标，比较不同试剂的脱杂蛋白效果和胶原蛋白流失情况。试验结果如图2所示。
根据图2可知，Na OH脱杂蛋白效果最好，但对胶原蛋白的损失量也最大；Na Cl、Na2CO3、Na CI与Na OH联用、Na Cl与Na2CO3联用这四种试剂进行脱杂蛋白时，胶原蛋白的流失率几乎相当，但Na2CO3的脱杂蛋白的效果最好，因此选择Na2CO3作为最佳的脱杂蛋白试剂。
2.2.2溶剂浓度对脱杂蛋白效果的影响
保持其他条件不变，分别配制0.2，0.4，0.6和0.8mol．L-1的Na2CO3溶液进行脱杂蛋白处理，不定时搅拌，浸泡10 h，吸取脱杂上清液，测定其在280 nm处的吸光度。试验结果如图3所示。
由图3可知，随着Na2CO3溶液浓度的增加，鱼皮中杂蛋白的脱除效果逐渐增强，当Na2CO3溶液的浓度超过0.6 mol．L-1后，随着浓度增加，脱杂蛋白效果变化不大，因此，选择0.6 mol．L-1作为Na2C03溶液的最佳浓度。
2.2.3温度对脱杂蛋白效果的影响
保持其他条件不变，分别调节脱杂温度为10℃，15 ℃，20℃和25℃，不定时搅拌，浸泡10 h，吸取脱杂上清液，测定其在280 nm处的吸光度。试验结果如图4。
由图4可知，随着温度的增加，蛋白质的三、四级结构解体，杂蛋白的脱除率随温度的增加逐渐增加，在25℃时吸光度最大，温度继续增加会导致胶原蛋白变性，因此选择杂蛋白脱除的最佳处理温度为25℃左右。
2.2.4浸泡时间对脱杂蛋白效果的影响
保持其他条件不变，用0.6 mol．L-1的Na2CO3溶液在25 0C下，不定时搅拌，分别浸泡6，10，14和18h，吸取脱杂上清液，测定其在280 nm处的吸光度。试验结果如图5所示。
由图5可知，脱杂时间对鱼皮中杂蛋白脱除效果的影响较小，脱杂处理6h后，杂蛋白的脱除率增加很少，当脱杂时间继续增加时，杂蛋白的脱除率反而降低，因此，选择最佳脱杂蛋白处理时间为6h。
2.2.5处理次数对脱杂蛋白效果的影响
按照上述结果进行处理，分别处理1，2，3和4次，吸取每次处理后的脱杂上清液，测定其在280 nm处的吸光度。试验结果如图6。
由图6可知，处理1～2次时，吸光度随着处理次数的增加而增加，2次过后吸光度基本保持不变，证明处理两次时基本上把杂蛋白脱除完了，所以脱杂蛋白时，处理两次效果即可。
鱼皮中杂蛋白脱除的最优工艺参数为：以0.6mol．L-1的Na2CO3溶液为杂蛋白脱除试剂，在25 0C下处理2次，每次6h。
2.3鲢鱼鱼皮脱脂工艺及参数优化
2.3.1试剂种类对鱼皮脱脂效果的影响
采用索氏抽提法测量鲢鱼鱼皮的脂肪含量约为4.19%左右，说明鱼皮中含有一定量的脂肪，如果不进行脱脂操作，可能会对后期胶原蛋白产品的纯化带来干扰。因此，需要对鱼皮进行脱脂处理。
分别采用正丁醇、无水乙醚、正丁醇与无水乙醚混合试剂处理鱼皮，料液比1：80( g/m L)，不定时搅拌，分离并回收溶剂后，鱼皮挥干溶剂，测定脱脂后鱼皮中脂肪含量，计算脂肪脱除率。试验结果如图7。
由图7可知，正丁醇脂肪脱除率为58.89%;无水乙醚脂肪脱除率为72.56%;正丁醇与无水乙醚混合试剂脂肪脱除率60.31%，说明鱼皮中脂肪在无水乙醚中溶解率最高，因此，选择无水乙醚作为最佳脱脂溶剂。
2.3.2脱脂时间对鱼皮脱脂效果的影响
保持其他条件不变，采用无水乙醚，分别浸泡鱼皮8，16，24和32 h，进行脱脂处理，测定脱脂后鱼皮中脂肪含量，计算脂肪脱除率。试验结果如图8所示。
由图8可知，随着脱脂时间的增加，脱脂率逐渐上升，当脱脂时间增加到16 h之后，随着脱脂时间的增加，脱脂率增加缓慢，因此，选择最佳脱脂时间为16 h。
2.3.3料液比对鱼皮脱脂效果的影响
保持其他条件不变，采用无水乙醚进行脱脂，分别调节料液比为1: 40，1: 60，1：80和1：100(g／m L)。测定脱脂后鱼皮中脂肪含量，计算脂肪脱除率。试验结果如图9所示。
由图9可知，料液比到达1：80( g/m L)时，脂肪脱除效果已达到最好，因此，选择最佳料液比1: 80( g/m L)左右。
因此，最佳脱脂工艺参数为：采用无水乙醚作为脱脂试剂，在料液比为1：80( g/m L)下处理16 h。
2.4鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的提取工艺优化
2.4.1 酶种类对鱼皮胶原蛋白提取率的影响
取预处理后的鱼皮两份，分别加入胃蛋白酶液和胰蛋白酶液(4 000 U．g-1)，调节料液比为1：60(g／m L)，提取后测定提取液中羟脯氨酸的含量，计算提取液中胶原蛋白的提取率，试验结果如图10所示。
从图10可以看出，胃蛋白酶对鲢鱼皮中胶原蛋白的水解效果优于胰蛋白酶，因此选择胃蛋白酶作为鲢鱼皮中胶原蛋白的水解酶。
2.4.2 胃蛋白酶用量对鱼皮胶原蛋白提取率的影响
取预处理后的鲢鱼皮，加入胃蛋白酶进行提取，保持其他条件不变，分别调节加酶量为1 000，2 000，3 000，4 000和5 000 U．g-1，计算提取液中胶原蛋白的提取率，比较不同胃蛋白酶液的用量对鱼皮胶原蛋白提取率的影响，结果如图11所示。
从图11可以得出结论，鲢鱼皮胶原蛋白的提取率随胃蛋白酶用量的增加而增加，在4 000 U．g-1时达到最大值，此后随着酶用量的增加，胶原蛋白的提取率增加缓慢，因此选择酶用量为4 000 U．g-1。
2.4.3料液比对鱼皮胶原蛋白提取率的影响
取预处理后的鲢鱼皮，加入胃蛋白酶液进行提取，以蒸馏水为浸提剂，保持其他条件不变，分别调节料液比为1：40，1: 50，1：60和1：70( g/m L)，计算提取液中胶原蛋白的提取率，比较料液比对鱼皮胶原蛋白提取率的影响，结果如图12所示。
由图12可以得出结论，当料液比从1：40～1：60( g/m L)时，鲢鱼皮胶原蛋白的提取率随提取溶剂的增加而增加，可能的原因是溶剂量增大时，鱼皮中的胶原蛋白可以与酶充分接触而被水解，当料液比从1：60( g/m L)降低到1：70( g/m L)后，提取率的增加变缓，考虑到节约试剂，因此，选择最佳料液比为1：60( g/m L)。
2.4.4浸提时间对鱼皮胶原蛋白提取率的影响
取预处理后的鲢鱼皮，加入胃蛋白酶进行提取，保持其他条件不变，分别提取4，6，8，10和12 h，计算提取液中胶原蛋白的提取率，比较不同胃蛋白酶液的用量对鱼皮胶原蛋白提取率的影响，结果如图13所示。
从图13可知，鲢鱼鱼皮胶原蛋白的提取率随浸提时间的增加而增加，提取时间从4h增加到8h，胶原蛋白的提取率增长速度很快，当浸提时间继续增加时，胶原蛋白提取率的增长速度减缓，故浸提时间选择8h为宜。
2.4.5酶溶性鱼皮胶原蛋白提取工艺优化的正交试验
根据单因素试验结果，选择胃蛋白酶液用量、酶解时间和料液比三个因素进行正交试验，以进一步确定鱼皮中酶溶性胶原蛋白提取的最优工艺参数，选用L9(34)正交试验表，因素水平表见表1，正交试验结果见表2。
由表2可知，各因素对鲢鱼皮中酶溶性胶原蛋白提取率的影响重要程度依次是：胃蛋白的用量>料液比>浸提时间，最优方案为A3B1C1，即酶用量4 000U-g-1，浸提时间6h，料液比1：50( g/m L)。
取预处理后的鲢鱼皮，加入胃蛋白酶进行提取，调节酶用量为4 000U．g-1，料液比为1：50（g/m L），浸提时间为6h，在此条件下对鲢鱼皮中的胶原蛋白进行提取，提取率为19.21%，高于正交试验中所有工艺参数组合下的提取率，证明了正交试验的正确性。
2.5鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的热变性温度测定
用去离子水配制0.6%浓度的酶溶性胶原蛋白水溶液，用AR-500动态流变仪分析温度对胶原蛋白影响的趋势，测定得到鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的热变性起始温度为31.80℃，峰值温度为34.54℃，因此，在提取过程中应该将温度控制在31.80 ℃以下。
3结论
以鲢鱼鱼皮为原料，分别对鱼皮中杂蛋白和脂肪的脱除工艺进行了研究，并对鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白的提取工艺参数进行了分析，测定了其热变性温度。试验结果表明，鲢鱼鱼皮原料中杂蛋白脱除的最佳工艺参数为以0.6 mol．L1的Na2CO3溶液为杂蛋白脱除试剂，在25 0C下处理2次，每次6 h；鱼皮原料中脂肪脱除的最佳工艺参数为采用无水乙醚作为脱脂试剂，在料液比为1：80( g/m L)下处理16 h；鲢鱼鱼皮中酶溶性胶原蛋白提取的最佳工艺条件为胃蛋白酶用量4 000 U．g-1，料液比1：50( g/m L)，浸提时间6 h：此胶原蛋白的热变性起始温度为31.80℃，峰值温度为34.54℃。
