两种酶制剂联合分步酶解低值虾的研究

 李静1，邓毛程1*，王瑶1，刘嘉俊1，陆志鸿2

 1．广东轻工职业技术学院（广州510300）；2．广州市味研生物工程科技有限公司（广州511300）

摘要为了利用低值虾生产应用于食品工业领域的低分子肽，试验研究了低分子肽酶解制取工艺。以低值虾为底物，分别利用中性蛋白酶和风味蛋白酶在最适合的条件下制取低分子肽(360～2 500 D a)，目标产物分别呈现较强苦味和较弱苦味，最大得率分别为31.85%和20.45%。以中性蛋白酶的产物为底物，利用加酶量为2 000 U/g的风味蛋白酶进一步酶解，酶解-2 h达到良好的脱苦效果，产物得率为25.23%，表明两种酶制剂联合分步酶解工艺有利于获得

较大量的、苦味较弱的目的产物。

关键词低值虾：低分子肽；酶解；苦味去除

 我国是虾类生产大国，每年产量都在100万t以上。捕捞获得的小虾，或加工过程产生的下脚料，统称为低值虾，约占总产量40%以上。低值虾富含蛋白质，但以简单加工方式难以从中获得人们食用的蛋白质产品，通常被用于生产虾酱或生产动物饲料。为了提高蛋白资源的利用价值，研究人员致力于利用低值虾开发氨基酸、活性肽和调味基料等产品，其中，应用于食品领域的热点产品是具有呈味、易吸收等特性的低分子肽。但是，肽链长短、氨基酸组成及排列等直接影响低分子肽的呈味，在酶解制取特定分子范围的肽类产品时，得率偏低是目前存在的主要问题。同时，由于酶解作用，疏水氨基酸的暴露导致低分子肽呈现苦味，影响低分子肽在食品领域的应用。试验利用低值虾制取低分子肽，侧重于提高低分子肽的得率和脱除其苦味，以期为低值虾的综合利用提供有价值的参考。

1材料与方法

1.1材料

 低值虾（蛋白含量56.12%）：深圳市观赏鱼饲料有限公司；中性蛋白酶( 6.0×104 U/g)、碱性蛋白酶（2.0×105 U/g）：北京奥博星生物科技有限公司；风味蛋白酶( 1.5×104 U/g)：诺维信（中国）生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（1.0×106 U/g）：广西庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶（1.0×104 U/g）：江苏富盛德生物工程有限公司；其它试剂：分析纯，市售。

1.2主要仪器与设备

 PHS-2S型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DMF-10A型摇摆式高速粉碎机：浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司；SHA-2型水浴恒温振荡器：金坛市瑞华仪器有限公司；KDC-210HR型高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；LNG-UF-101型超滤机：上海朗极膜分离设备工程有限公司：VFB-1000型真空冷冻干燥机：上海比朗仪器制造有限公司；L-8800型氨基酸自动分析仪：日本日立公司。

1.3酶制剂的优选

 将低值虾干粉碎，过100目筛，称取20 g粉体，加入纯净水使液固比达30：1（m L/g），分别加入中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量为2 000 U/g（蛋白质），分别在各种酶制剂的最适pH和最适温度下进行酶解10 h。酶解后，于10 000 r/min的条件下离心15 min，取清液，测定氨基酸态氮，并计算蛋白质水解度，据此优选酶制剂。参照文献计算蛋白质水解度。

1.4酶制剂用量的优选

  利用优选酶制剂和使用不同的酶量，在酶解过程中，每隔1h测定酶解液的氨基酸态氮，并计算蛋白质水解度，据此优选酶制剂用量。

1.5低分子肽酶解制取

  按最佳用量的投入单一酶制剂，在特定时间下进行酶解，利用超滤装置对酶解液进行分离，收集分子量为360～2 500 D a的浓缩液，经冷冻干燥，称其质量，计算低分子肽的得率，并感官评定低分子肽的苦味。低分子肽的得率按公式(2)计算。

1.6联合酶解去除苦味

 在1.5试验基础上，将得率最高的低分子肽配制成溶液（液固比30：1 m L/g），加入风味蛋白酶，加酶量为2 000 U/g，在pH 6.5、50 ℃的条件下进行酶解脱苦，酶解反应时间分别为30，60，90，120，150，180，210和240 min。利用氨基酸分析仪测定溶液中酶解前、后的游离氨基酸。然后，按1.5所述方法，获得分子量为360～2 500 D a的干燥产物，计算低分子肽的得率和评定低分子肽的苦味。

1.7低分子肽苦味评价

 将低分子肽配制成30 g/L的样液，由7名有经验人员组成评定小组对其苦味进行评定，评定方法参照文献的感官分析方法。以硫酸奎宁溶液为标准对照物，分别配制成1.28×10-4，0.64×10-4，0.32×10-4，0.16×10-4,  0.08×10-4和0.04×10-4 mol/L溶液，分别对应的苦味强度和苦味值：苦味很强，苦味值为5；苦味强，苦味值为4；苦味较强，苦味值为3；苦味较弱，苦味值为2；苦味微弱，苦味值为1；无苦味，苦味值为0。依据感官评定程序，比较样液与标准液的苦味，以苦味相近原则确定样液的苦味值。

1.8测定方法

 利用氨基酸自动分析仪测定样品的游离氨基酸。测定前，先将溶液于12 000 r/min的条件下离心20 min，取清液，过膜（0.22μ m），然后上机检测，检测条件。酶解液中氨基酸态氮的测定采用甲醛滴定法。低值虾的总氮测定采用微量凯氏定氮法。蛋白酶活力的测定采用Fo lin试剂法，酶活力单位定义为每分钟水解酪蛋白产生1μ g酪氨酸的酶量，以U

表示。

2结果与分析

2.1不同酶制剂的酶解能力

 以不同蛋白酶对低值虾进行酶解，蛋白质的水解度如图1所示。蛋白质的氨基酸组成和排列对蛋白酶的酶解作用有影响，不同蛋白酶对同一底物的水解效果有差异。以低值虾的蛋白质为底物，中性蛋白酶的酶解作用最强，其次是风味蛋白酶。在最适条件下，中性蛋白酶和风味蛋白酶的水解度分别为45.41%和40.66%，可优选为进一步研究的酶制剂。

2.2不同加酶量的酶解能力

 分别以不同用量的中性蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解试验，水解度分别如图2和图3所示。随着加酶量增大，两种蛋白酶的水解能力呈增强趋势。当中性蛋白酶和风味蛋白酶的用量分别增加至3 000 U/g和4 000U/g，在7h的水解度接近最大值，继续增大加酶量，或继续延长时间，水解度增大不明显。从节约酶制剂用量和水解时间考虑，中性蛋白酶和风味蛋白酶的最适用量分别优选为3 000 U/g和4 000 U/g。

2.3不同时间的产物得率和苦味分析

 分别在中性蛋白酶和风味蛋白酶的最适加酶量下进行酶解，分子量为360～2 500 D a的低分子肽的得率和苦味值如图4和图5所示。在中性蛋白酶作用过程中，低分子肽的得率先呈逐步上升趋势，在酶解4h达到最高值(31.85%)，尔后又逐步下降。与中性蛋白酶相比，风味蛋白酶产生低分子肽的得率要低很多，其最大得率仅为20.45%．出现在酶解5h。但是，中性蛋白酶是内切酶，它能够随机切断肽链任意肽键位置，有可能使较多疏水氨基酸暴露于肽链两端，致产物呈较强苦味，苦味值为3.7。风味蛋白酶是内切酶和外切酶的混合物，由于外切酶可以水解肽链末端释放疏水氨基酸，故酶解产物的苦味值仅为1.6。基于中性蛋白酶和风味蛋白酶各自的优点，有必要联合利用这两种酶制剂进行分步酶解试验，以同时获得较高的产物得率和较弱的苦味。

2.4联合酶解的产物得率和苦味分析

 收集中性蛋白酶酶解产生的低分子肽，利用风味蛋白酶继续酶解，低分子肽的得率和苦味值如图6所示。由于酶制剂中外切酶和内切酶的同时作用，随着水解时间的增加，目标产物得率和苦味值均呈下降趋势。从苦味去除效果来看，在风味蛋白酶继续作用2h后，低分子肽的苦味值降低至1.9以下，接近风味蛋白酶单独酶解的结果。从低分子肽的得率来看，在风味蛋白酶继续作用2～3 h期间，得率均高于风味蛋白酶单独酶解的得率。结果表明，采用两种酶制剂分步酶解，有利于保持较高的产物得率和有效降低产物的苦味值。联合酶解的实际意义在于尽可能保持较高的产物得率，故选择风味蛋白酶继续作用的时间为2h，此

时的得率和苦味值分别为25.23%和1.9。

2.5游离氨基酸的分析

 利用加酶量为2 000 U/g的风味蛋白酶对中性蛋白酶酶解产物进行脱苦，脱苦前后游离氨基酸变化情况如表1所示。经过风味蛋白酶水解2h，低分子肽溶液中游离氨基酸的增加幅度较大，增加总量达7 714.28 g/L。在游离氨基酸中，疏水氨基酸所占比例为44.40%，其中，亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸等疏水氨基酸增加量较大。游离氨基酸分析结果表明，风味蛋白酶可以水解释放大量的疏水氨基酸，使对中性蛋白酶酶解产物的苦味大幅度减弱。

3结论

 中性蛋白酶和风味蛋白酶对低值虾都具有较强的水解能力，它们的最佳加酶量为3 000 U/g和4 000 U／g。分别利用中性蛋白酶和风味蛋白酶在最适合的条件下制取低分子肽( 360～2 500 D a)，目标产物分别在酶解4h和5h获得，得率分别为31.85%和20.45%，分别呈现较强苦味和较弱的苦味。以中性蛋白酶的产物为底物，利用加酶量为2 000 U/g的风味蛋白酶进一步酶解脱苦，酶解2h的产物得率为25.23%，产物苦味较弱，此时酶解液中游离氨基酸增量为7 714.28 g／L，其中疏水氨基酸占44.40%。结果表明，利用两种酶制剂进行联合分步酶解，可以在较高的得率水平基础上获得苦味较弱的目的产物。研究结果可为低值虾工业化生产低分子肽提供有价值的参考。