抗氧化剂促进红曲菌固态发酵生产红曲黄色素

 贾氏臣，赵树欣*

 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院（天津300457）

摘要红曲菌生产的红曲黄色素，已经被证明是良好的抗炎症、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化和抗肥胖药物。但是有毒的物质橘霉素也在红曲茵发酵过程中产生。在试验中，通过添加抗氧化剂利用固态发酵优化红曲菌FJ3高产红曲黄色素，同时降低橘霉素产量。在选用的4种抗氧化剂中，半胱氨酸和植酸钙对黄色素具有良好的促进作用，维生素C、植酸钙和乳酸钙对橘霉素具有良好的抑制作用。通过正交试验优化各个抗氧化剂的添加量，在维生素C、半胱氨酸、植酸钙和乳酸钙的添加量分别为16.0，6.0，1.4和8.0 g/kg时，黄色素的产量达最大，为2 988 U/g(优化前的6.80倍)，色调为1.39（优化前的1.45倍），同时橘霉素产量为0.017 6 mg/g(优化前的约1/2)。

关键词红曲菌；黄色素；抗氧化剂；固态发酵；正交试验

 红曲菌可以生产多种生物活性物质，红曲色素就是其中重要的一种，红曲色素可以分为红、橙、黄三种色素，最基本的有6种，随后又发现了50多种。

 红曲黄色素-Monascin(MS)和Ankaflavin( AK)，具有很多的生理功能，比如抗炎症、抗癌症、抗氧化、抗肥胖和抗糖尿病，还可以通过降低总胆固醇、甘油三酸酯和低密度脂蛋白的水平量降低血脂。

 Wei-Hsuan Hsu等研究表明MS可以在肿瘤坏死因子a-TNF处理的C2C12肌小管中通过减少氨基末端激酶(JUN)磷酸化和抑制过氧化物酶体增殖物激活受体y( PPARy)磷酸化，来提高胰岛素敏感度，并且还可通过抑制蛋白质酪氨酸磷酸化1B( PTPIB)的表达来减少胰岛素耐受性，使葡萄糖转运体( GLUT)移动到细胞膜上，随后促进葡萄糖的摄取，从而起到抗糖尿病的效果。AK可以控制一些转录因子，比如PPAR-r．PPAR-a和Nrf2，来阻止代谢综合症和其他疾病。AK通过激活PPAR-r和PPAR-a提高脂类物代谢作用，增加胰腺功能来降低高血糖症。MS和AK可以防止前脂肪细胞的增殖，分化和促进成熟脂肪细胞的基础分解，从而避免脂质的累积。

 如图1从红曲色素的代谢途径可以看出，色素在红曲菌中首先合成橙色素，橙色素通过转氨作用生成红色素，同时橙色素还可以通过还原反应生成黄色素，因此添加抗氧化可以通过提供氧供体，使得橙色素更有利于流向黄色素，从而增加黄色素的产量。

目前，针对抗氧化对红曲色素的研究，主要集中在对色素的保护作用上，研究抗氧化剂在发酵过程中对色素生成影响的非常少。根据GB 2760-2014食品添加剂使用标准选取抗氧化剂，研究了它们在红曲色素固态发酵过程中对色素及橘霉素代谢生成的影响。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株

 红曲菌FJ3为天津科技大学生物工程学院保藏菌种。

1.1.2培养基

 菌株活化培养基：麦芽汁琼脂培养基：13 0Bx的麦芽汁，琼脂粉2%；液态种子培养基：5%大米粉培养基，pH自然；固态发酵培养基：30 g籼米/250 m L_角瓶，加水浸泡12 h，淋水调节含水量至35%。

1.1.3试剂

 抗坏血酸：天津市化学试剂一厂；L-半胱氨酸：天津市福晨化学试剂厂；植酸钙：成都化夏化学试剂有限公司；乳酸钙：北京化工厂；橘霉素标准品：Sigma公司；乙腈：赛默飞世尔科技有限公司；其他均为分析纯级别。

1.1.4仪器

 Agilent 1200 series高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司，MJ-Ⅱ霉菌培养箱：上海一恒科技有限公司，电子分析天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司，UV5100型紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

1.2试验方法

1.2.1  菌种培养和发酵条件

 种子：接种孢子悬液1 m L，30℃110 r/min培养48 h；发酵：10%的接种量接人种子液，30℃，65%的湿度下培养6d。

1.2.2发酵产物的测定

 色价根据GB 4926-2008中红曲色素的测定方法进行测定；橘霉素根据GB/T 5009.222-2008红曲类产品中橘霉素的测定方法进行测定。

2结果与讨论

2.1维生素C对FJ3固态发酵产物的影响

 维生素C是一种常见的水溶性抗氧化剂。白色或略带淡黄色结晶或结晶性粉末，无臭，有酸味，易溶于水。试验中维生素C的梯度添加量为0，5，10，15和20 g/kg，所得数据见图2。

 从图2中可以看出随着维生素C添加量的增加，色素的产量表现出先增加后减小的趋势，在添加量在15g/kg达到最大。此时，黄色素的色价最高，其次是红色素，最低的是橙色素，三种色素分别是空白对照组的2.83，3.05和3.17倍。增加幅度很大。同时此时橘霉素的产量也有明显的降低，是对照组的1/3。选定维生素C的中心点添加量为15 g/kg。

2.2半胱氨酸对FJ3固态发酵产物的影响

 半胱氨酸是无色至白色细柱状结晶或粉末，有轻微特殊气味和滋味溶于水。试验中半胱氨酸的梯度添加量为0，5，10，15和20 g/kg，所得数据见图3。

 从图3中可以看出，随着半胱氨酸添加量的增加，色素的产量先增加后降低，在添加量为5 g/kg时达到最大。此时，三种色素的色价黄色最高，红色次之，橙色最小，分别是空白对照组的2.90，2.14和2.63倍，黄色价增加幅度很大，添加半胱氨酸有利于增加黄色素的产量。同时橘霉素的产量也有1.40倍的增加，但是增加幅度没有色素的大，可以在进行添加量的优化来平衡它们。选择半胱氨酸的中心点添加量为5 kg。

2.3植酸钙对FJ3固态发酵产物的影响

 植酸钙为白色粉末，可作为营养药，有促进新陈代谢，增进食欲和营养，助长发育等作用。试验中植酸钙的梯度添加量为0，0.5，1.0，1.5和2.0 g/kg，所得数据见图4。

 从图4中可以看出随着植酸钙添加量的增加，色素的产量表现出现逐渐增加的趋势，在1.0 g/kg时达到稳定，此时，红橙黄三种色素的产量分别是空白组的3.94, 4.65和5.06倍，黄色素产量的增加速率要高于红橙两种色素，这就说明添加植酸钙有利于红曲菌固态发酵生产黄色素。同时，添加植酸钙对橘霉素的产量也会有明显的抑制作用，是对照组的1/3，选定植酸钙的中心添加量为1.0 g/kg。2.4乳酸钙对FJ3固态发酵产物的影响乳酸钙，白色至乳白色结晶或粉末，基本无臭无味。易溶于热水成透明或微混浊的溶液。试验中乳酸钙的梯度添加量为0，5，10，15和20 g/kg，所得数据见图5。

 从图5中可以看出随着乳酸钙添加量的增加，色素的产量表现出先增加后减小的趋势，当乳酸钙的添加量在5 g/kg达到最大。此时，红、橙和黄三种色价中，红色素的色价最高，其次是黄色素最低的是橙色素，三种色素分别是空白对照组的1.66，1.68和1.64倍。增加幅度很大。同时此时橘霉素的产量也有明显的降低，是对照组的1/2，选择乳酸钙的中心添加量为5 g/kg。

2.5正交试验

 根据单因素试验得到各个因素的中心点，再加上一个空白因素进行正交试验，因素水平表见表1，试验数据及直观分析见表2，方差分析见表3。

 从表2直观分析表中可以看出，对黄色价、黄色调和橘霉素产量影响的顺序为半胱氨酸(B)>乳酸钙(D)>维生素C(A)>植酸钙(C)，表3中可以看出，除了半胱氨酸对黄色素产量和黄色调具有显著的影响(p<0.10)外，其他因素都对黄色素和黄色调影响菌不显著，所有因素对橘霉素影响均不显著。但是橘霉素的产量均比未优化前降低很多，降低倍数在1.79～4.36倍。根据直观分析表影响色价最优添加方案为A4B1C4D4，影响色调最优添加方案为A2B4C4D1。

 从显著性分析中可以看出，半胱氨酸是影响色价和色调的关键因素，同时两者又是一个矛盾的，

 比较色价、色调和橘霉素的产量来看可以得出在添加方案为A4B3C4D4时达到最好。此时维生素C、半胱氨酸、植酸钙和乳酸钙的添加量分别为16.0，6.0，1.4和8.0 g/kg，黄色素的产量达到2 988 U/g（优化前的6.80倍），色调为1.39（优化前的1.45倍），橘霉素为0.017 6 mg/g（优化前的约1/2）。

3结论

 1)在红曲固态发酵培养基中，添加食品中允许添加的抗氧化剂，有利于红曲黄色素的积累，同时还可以有效地抑制橘霉素的产量。通过单因素试验可以得到半胱氨酸和植酸钙对黄色素具有良好的促进作用，而维生素C和乳酸钙对橘霉素具有良好的抑制作用。

 2)通过正交试验可以得到培养基中添加维生素C16.0 g/kg，半胱氨酸6.0 g/kg，植酸1.4 g/kg，乳酸8.0g/kg时，黄色素的产量达到最大2988 U/g，是优化前的6.8倍。色调为1.39，是优化前的1.45倍。同时橘霉素的产量为0.017 6 mg/g，是优化前的1/2。