海藻酸钠在淀粉酶的固定化中的应用

 吴效楠，温守东，刘涛

 承德石油高等专科学校化学工程系（承德067000）

摘要海藻酸钠是一种安全性较高且生产成本较低的材料，淀粉酶在食品工业、造纸业、酒精行业及日化用品等多个领域应用广泛。海藻酸钠由于其生物安全性、良好的成胶成球特性及低廉的生产成本在酶的固定化方面有较广泛的应用。单一淀粉酶对pH及有机溶剂较敏感，高温下不够稳定，在一定程度上限制了其应用。因此’需要对淀粉酶进行固定化以提高其稳定性。将对海藻酸钠固定淀粉酶的进展进行综述并对未来的发展进行展望。

关键词  海藻酸钠；淀粉酶；固定化；稳定性

  海藻酸钠是一种来源与海藻中的天然多糖，由于其稳定性、溶解性和安全性用作药物制剂辅料以及酶制剂的固定化。

 淀粉酶是水解淀粉和糖原糖类的总称，淀粉酶由  于其高效性、专一性及生物安全性被广泛应用于面包烘烤、饮料制备、纤维脱浆、造纸工业、除垢剂、临床制药和化学分析等方面。淀粉酶在很多条件下需要在温度比较高、偏酸偏碱或表面活性剂存在的环境下应用。因此，对淀粉酶的稳定性要求较高。固定化酶是指在一定空间内呈现封闭状态同时能保留其催化特性并能反复回收利用的酶。

 固定化酶相比游离酶具有稳定性更强、更耐酸耐碱、可反复使用降低成本、可对反应进行精确控制、对蛋白酶的耐受性更强和更耐变性剂等优点。因此，十分有必要对淀粉酶的固定化工艺进行深入研究，而海藻酸钠是较为成熟的酶固定化载体，具有成本低、生物安全性好和固定酶容量较大等优势，因此对海藻酸钠在酶固定化方面的应用进行综述。

1  酶固定化载体及方法

1.1酶固定化载体

 载体是对酶进行固定化的关键，理想的酶固定化载体应该具有如下特性：(1)生物安全性较好；(2)性质稳定，不易被降解；(3)传质性能良好；(4)机械强度高，使用寿命长；(5)不与反应液及产物发生化学反应；(6)操作简便且成本低廉。常用的固定化载体可以分为无机载体、有机高分子载体和天然高分子载体。天然高分子载体包括海藻酸钠、琼脂、纤维素和壳聚糖等；有机高分子材料包括光交联树脂、聚氨酯、聚乙烯醇、硅胶和聚丙烯酰胺等。有机高分子载体一般稳定性和机械强度较好，但传质性能相对较差。天然高分子凝胶一般传热传质性能较好，但机械强度相对较弱。

1.2酶的固定化常用方法

 酶的固定化是指采用物理或化学方法将蛋白酶以物理吸附方式、共价键结合或非共价键结合等方式，将酶固定于特定的载体上，将酶束缚在特定区域的同时保持酶的催化特性。固定化酶要遵循以下原则：(1)维持酶的催化活性及专一性；(2)载体必须有足够的机械强度；(3)固定化酶载体的空间位阻要尽量小，减少对酶和底物结合的影响；(4)酶与载体要牢固结合，利于反复使用；(5)固定化酶要易于与产物分离；(6)要具有很好的稳定性，成本要相对低廉。常见的酶固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法、共价结合法和热处理法5种方法。这种方法工艺简便，条件温和，可同时实现酶的固定和纯化。

1.2.1吸附法

 吸附法是指通过载体表面与酶分子间次级键的相互作用而制备固定化酶的方法，可分为物理吸附法以及离子交换吸附法，吸附法具有操作方便，所需条件温和，固定化酶的活力回收率较高，载体可再生，成本较低，有时可同时实现酶的固定和纯化等优点。但这种方法固定的酶与载体之间的相互作用力太弱，主要包括氢键、离子键和疏水键等，容易受到缓冲液pH、离子强度等的影响导致蛋白酶与载体的分离。

  1.2.2包埋法

 包埋法是采用凝胶、微囊、脂质体和半透膜将酶包埋在其中，所以可分为凝胶包埋法、半透膜包埋法、微囊包埋法和脂质体包埋法四种。这种方法的操作条件较为温和，对酶的功能特性影响较小，酶与载体的结合力较强，成本较低。如海藻酸钠固定蛋白酶一般采用凝胶包埋法，以增加淀粉酶的稳定性及对极端环境的耐受性。可以用聚丙烯酰胺凝胶包埋含延胡索酸的产氨短杆菌菌体，制成固定化延胡索酸酶，从延胡索酸制造L-苹果酸。

1.2.3交联法

 交联法是将游离酶的氨基酸残基与不同的交联剂反应使两者之间产生化学键从而对酶进行固定化，使用交联法载体与酶之间的结合力很强，固定强度大，可以长时间使用。但这种方法也存在缺点，即所采用的交联剂一般为有机过氧化物，最常用的为氧化二异丙苯，反应条件比较剧烈，对酶的活力影响比较大，因此，酶活力回收率低，交联法一般与其他方法联合使用，如与吸附法或包埋法联合使用，可以降低对酶活力的损害。目前交联法主要应用在酶膜和免疫分子膜的制备中。柯德森等利用戊二醛可以与蛋白酶的游离氨基酸形成Schiff碱而使酶分子交联的原理对糖化酶进行固定，并优化了戊二醛固定糖化酶的条件，发现酸性条件下，低于0.5%的戊二醛浓度进行固定化有利于提高固定化酶的稳定性。

1.2.4共价结合法

 共价结合法是将酶与载体通过共价键（包括巯基、羟基、羧基、氨基、酚基和咪唑基等）结合从而对酶进行固定化的方法。这种方法酶与载体间的结合相对牢固，固定化酶的稳定性较好，可以进行多次反应。但这种方法反应条件剧烈，会在一定程度上破坏蛋白质的高级结构，因此，对酶活力损失较大，一般酶活回收率在30%左右。而且共价结合法固定化酶对底物的专一性有影响，制备工艺复杂，固定化成本较高。

1.2.5热处理法

 热处理法是指将含有酶的细胞在一定温度下进行加热处理，从而将酶固定在菌体内部。该方法工艺相对简单，成本也低廉，但该方法仅仅适用于具有较好热稳定性的酶。例如将含葡萄糖异构酶的放线菌细胞在660C～65 0C处理15 min，葡萄糖异构酶就固定在菌体上，可用于连续生产葡萄浆。

1.2.6结晶法

 结晶法固定化酶就是酶结晶的方法实现酶的固定化。酶晶体可以实现酶的富集，提供高浓度的酶，这对于活力低的酶非常重要，因为通过结晶可以提高单位体积内酶的活力，这可以大大缩短酶的反应时间。但结晶法固定化酶存在一定的损耗，成本也相对较高。

2海藻酸钠固定化淀粉酶研究进展

 理想的载体对酶进行固定化后对酶的性质改变如下：(1)固定化酶的热稳定性比游离酶好，一般来说最适反应温度升高，对蛋白酶的抗性增加，对变性剂的耐受性提升；(2)采用带正电荷的载体固定化酶时，最适反应pH会有所降低，采用带负电荷的载体固定化酶时，最适反应pH升高；不带电荷载体固定化酶则对最适反应pH没有影响；(3)如果酶的底物为

小分子，则载体的空间位阻对于酶与底物的结合影响较小，则底物特异性改变不大；如果酶的作用底物为大分子，则载体会影响酶与底物的结合，酶的底物特异性会发生变化。(4) -般来说固定化酶的米氏常数要高于游离酶，这是因为载体的空间位阻妨碍底物进入到固定化酶中，因此，底物需要更高的浓度才能达到最大反应速度。

2.1海藻酸钠适合作为固定化酶的载体

 海藻酸钠是从海水中提取的亲水性胶态多聚糖，英国化学家最早于1881年在对海藻的海藻酸盐进行提取时获得，发现其具有浓缩原料和成膜能力，其分子式如图1所示，它由β-(1，4)-D-甘露糖醛酸（M单元）和a-(1，4)-L-古罗糖醛酸（G单元）组成，由于其分子中含有较多的自由羧基和羟基，可溶于不同温度的水中，因此其生物相容性较好，海藻酸钠本质是一种多糖，因此安全无毒，其成膜性能和成球性能好，是固定化酶理想的载体材料。

  海藻酸钠能与钙离子结合形成特殊的“Egg-box”结构，基于海藻酸钠的这种特性，可以联合氯化钙水溶液和海藻酸钠从而实现对酶的固定化。

2.2海藻酸钠在淀粉酶固定化中的应用

 淀粉酶是能水解淀粉和糖原的酶类的统称，是迄今为止用途最广泛、产量最大的酶制剂之一。根据水解淀粉方式和作用底物的不同，可以分为a-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖糖淀粉酶和解枝酶四种。淀粉酶可以广泛应用于食品加工、粮食工业、纺织工业、酒精工业和发酵工业等多种行业，是应用最广泛的酶制剂之一。

 由于淀粉酶应用范围广泛，而且经常需要应用于高温、偏酸、偏碱和多种表面活性剂存在的特殊环境中，单纯的淀粉酶对于酸、碱及有机溶剂十分敏感，在加工过程中十分容易失活。因此，需要对淀粉酶进行固定化以提高酶的稳定性和对极端环境的耐受性。

2.2.1  采用海藻酸盐以外的高分子载体固定化淀粉酶

 我国在淀粉酶的固定化方面取得了一系列进展，陈莉敏等以壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂对淀粉酶进行固定化，结果表明，经过固定化后，酶的最适反应pH未发生变化，而戊二醛导致淀粉酶的活性明显下降。王玉洁等以乙基纤维素为载体，利用高分子沉淀技术制备a-淀粉酶，可以较好地对a-淀粉酶微胶囊化并得到较高的产率。玄光善等以尼龙为载体，通过化学键合法对a-淀粉酶进行固定化。经过固定化后，酶的最适pH由6.3升至7.2，最适反应温度由60℃提高至70℃，固定化酶的热稳定性较好，固定化酶在4℃水溶液中放置14 d仍然可以保留79%～89%的酶活力，固定化酶应用于邻硝基对于对甲基苯酚的还原率为37.1%。张青等采用碳纳米管对淀粉酶和糖化酶进行了共固定，首先用硝酸回流法对碳纳米管进行纯化，再用混酸法对其进行氧化，在碳纳米管上引入羧基，固定pH为5.0，反应温度为20℃，共固定酶的酶活力能保持在60%以上，比固定单一酶生成葡萄糖的速率要高l5%。

2.2.2海藻酸钠在固定化淀粉酶方面的应用

 朱启钟等分别采用壳聚糖交联法和海藻酸钠微胶囊法对淀粉酶进行了固定化，采用海藻酸钠固定化的淀粉酶酶活力为27.4 U/mg，酶活力回收率为33.2%，采用壳聚糖交联法固定化淀粉酶的活力为24.2 U/mg，酶活力回收率26.6%。壳聚糖交联法制备的固定化酶在40℃～60℃保持较高的酶活力，而海藻酸钠固定化酶在50℃～80℃保持较高酶活力。可能是酶经过固定化后，刚性增加，需要较高的温度，提高其柔性，以便于底物与固定化酶的结合。海藻酸钠固定化酶的最适pH为8.0，而壳聚糖的最适反应pH为5.0，前者抗pH变化的能力更强，前者的贮藏稳定性也优于后者，抗高温能力也更强，前者机械强度也更强，反复使用10次还能保持80%以上的酶活力，初步推测主要是因为两者所带的基团不同以及形成凝胶网状的结构及机械强度不同所致。充分说明海藻酸钠更适合于淀粉酶的固定化。陈青等采用响应面法对海藻酸钠固定淀粉酶的条件进行了优化，发现海藻酸钠浓度为2.48%，氯化钙浓度为2.04%，游离酶浓度为0.23%，在此条件下，固定化酶的回收率高达74%。

2.2.3海藻酸钠联合其他载体固定化淀粉酶

 单一采用海藻酸钠固定淀粉酶可能在酶的稳定性、载体的机械强度及酶对环境的耐受性方面仍有待提高，因此，许多研究者展开了海藻酸钠联合其他载体固定化淀粉酶方面的研究。祝美云等以海藻酸钙、明胶和戊二醛为载体材料，对a-淀粉酶进行固定化，并探讨了酶的最佳固定化条件和固定化酶的酶学性质，酶经过固定化后，酶的最适反应pH由6.0降至5.6，最适反应温度由65℃提高至70℃，固定化酶的热稳定性显著提升。连续应用7次后仍然能保持80%左右的酶活力。

 顾旭炯等联合使用海藻酸钠和氯化钙，采用凝胶包埋法共固定a-淀粉酶和糖化酶，共固定化酶体系的最适反应温度为60℃，最适pH为4.5，固定化酶的热稳定性和连续操性都比较好。

 唐鹏程等采用海藻酸钠和卡拉胶共包埋固定化淀粉酶，所得固定化酶的酶活力回收率为5 5.7%，最适反应pH由7.0降至6.0，最佳反应温度由60℃提高至70℃，所得固定化酶在连续操作5次后还能保持75%以上的酶活力，其热稳定性也得到显著提高。

 王冕等采用海藻酸钠与阿拉伯胶为载体固定糖化酶，以酶活力的回收率作为评价指标，通过响应面法优化固定化条件，得到固定化酶的最佳工艺条件为海藻酸钠与阿拉伯胶质量比为2.7：1，氯化钙质量浓度为62 mg/m L，固定化时间为0.8 h，固定化酶的酶活回收率为67.91%。固定糖化酶的热稳定性有所提升。

3结论与展望

 海藻酸钠由于其安全性、低成本、良好的成球成膜性、高机械强度和稳定性被广泛应用于酶的固定化。淀粉酶由于其广泛应用于各个工业领域且淀粉酶本身对于酸碱及各种有机溶剂比较敏感，因此，海藻酸钠适合应用于淀粉酶的固定化，以提高淀粉酶的稳定性及其对于极端环境的耐受性。相比其他固定化载体，海藻酸钠具有制备简单、机械强度高、稳定性

好、反复多次使用后仍保持较好的酶活力、酶活力损失小并可以在很大程度上提高淀粉酶的热稳定性的优点。但在海藻酸钠固定化淀粉酶的过程中，仍需注意以下几点：  (1)固定化淀粉酶的工艺包括pH、温度、海藻酸钠浓度和酶浓度等需要进行优化，以最大程度提高蛋白酶的酶活力回收率；(2)可以结合其他载体材料如明胶、卡拉胶、黄原胶和碳纳米管等固定化淀粉酶，以最大程度提高固定化酶的稳定性；(3)可以共包埋其他酶包括糖化酶等，通过酶的协同作用以最大程度提高酶的活力及稳定性；(4)可以通过基因工程手段对淀粉酶进行遗传工程改造，以最大程度提高淀粉酶的活力及热稳定性。相信随着材料学、分子生物学及机械化工艺的发展，海藻酸钠在淀粉酶的固定化方面可以更好地发挥其作用，以提高淀粉酶的酶活力及稳定性，促进淀粉酶在各个工业领域的应用。