甘薯渣发酵制备低聚糖的自然菌株筛选初鉴

 庞林江1，王菩艺1，李燕1，王允祥2，成纪予1，路兴花1

 1．浙江农林大学农业与食品科学学院（杭州311300）；2．浙江农林大学暨阳学院（杭州311300）

摘要将从自然界土壤中获得10株降解菌以纤维素水解圈与淀粉水解圈为指标进行初筛，并以发酵液中低聚糖产量为指标进行复筛，确定了X1菌种发酵低聚糖的产量最高。参照《链霉菌鉴定手册》，结合电镜形态特征、培养特征和生理生化试验结果，初步判定菌株X1为链霉菌属白孢类群。研究结果表明利用自然界微生物法降解甘薯渣制备低聚糖的方法具有可行性。

关键词甘薯渣；低聚糖；生物发酵；自然菌株筛选

  甘薯渣作为一种经济价值较低的加工副产物，大多被作企业作为废料直接排放，这样不仅造成资源浪费还污染环境。其实废弃的薯渣中还含有大量的营养物质，如一些有益健康的碳水化合物：膳食纤维、低聚糖和抗性淀粉等。其中纤维素还可以用来制取燃料酒精，纤维水解液可以发酵生产琥珀酸等。除此，薯渣中的纤维素和淀粉还可以成为低聚糖的生产原料。目前，国内外有关利用甘薯渣制备低聚糖的研究较少，大多是关于薯渣中纤维素、果胶的提取和薯渣粉的报道。而其他薯类淀粉制备低聚糖的研究已进入较成熟阶段。薯类低聚糖的制备主要是以全薯中的淀粉或纤维素为原料利用微生物发酵法和酶解法，国外P．T．Sangeetha利用米曲霉液态发酵蔗糖生产低聚果糖，Solange I．Mussatto利用曲霉固态发酵农产品加工业的残留物生产低聚果糖。国内童星、王镇发和吴孔阳等通过薯类淀粉制备低聚异麦芽糖，杨文军等用马铃薯淀粉制备磷酸寡聚糖。

 选择对自然界菌株进行筛选得出一株纤维素和淀粉降解能力较强的甘薯渣发酵菌种，并进行液态发酵来降解甘薯渣。期望能通过这种环保的微生物降解方法来大幅提高甘薯渣中低聚糖的含量，从而使甘薯渣能够得到更有效的无公害和资源化利用。

1  材料与方法

1.1主要试剂和仪器

 CMC-Na、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、酵母膏、水解酪素。

 琼脂、可溶性淀粉、碳酸镁、硝酸钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铁、刚果红、苯酚、浓硫酸、葡萄糖。

 电热恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、洁净工作台、手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器、气浴恒温振荡器、离心机、紫外可见分光光度仪、恒温加热磁力搅拌器、循环水式真空泵、电子天平、pH计。

1.2试验方法

1.2.1原材料的采集

1.2.1.1土壤的采集

 分别采至浙江农林大学官塘、后山、东边树林、杭州西湖枯叶腐土之下及甘薯废弃物周围共5份。

1.2.1.2甘薯渣的获得

 由浙江农林大学甘薯研究所基地提供，模拟工厂流程，切块，打浆，沉淀，去淀粉，然后于60℃烘箱  烘干粉碎，过60目筛，即得甘薯渣。

  1.2.2培养基的制备

 试验共配制1 5种培养基：羧甲基纤维素钠琼脂培养基、淀粉水解琼脂培养基、种子培养基、发酵培养基、高氏I号合成培养基、察氏培养基、葡萄糖酵母培养基、马铃薯浸汁琼脂培养基、营养琼脂培养基、Bennett培养基、明胶液化培养基、牛奶凝固胨化培养基、Tresner培养基（产H2S）、酪氨酸琼脂培养基、碳源利用基础培养基。

1.2.3降解菌的分离与纯化

 先配置样品的稀释液和降解菌的分离及纯化，并将纯化后的降解菌单菌落接于羧甲基纤维素钠琼脂斜面上，30℃培养5d后4℃保存于冰箱备用，3～6个月转接一次。

1.2.4甘薯渣发酵菌株的初筛与复筛

 利用纤维水解圈与淀粉水解圈的方法进行初筛，再将发酵培养基中接种进行发酵液制备并对其进行低聚糖产量的测定。从而进行目标菌株的筛选并进行初步鉴定。

1.2.5菌株的初步鉴定

 菌株的形态特征观察采用插片法。培养特征观察是将目标菌株分别接种到高氏1号合成培养基、察氏培养基、葡萄糖酵母培养基、马铃薯浸汁琼脂培养基和营养琼脂培养基中，28℃培养，分别在5，7，1 2和20 d观察其培养特征。生理生化鉴定主要是进行pH、温度和Na Cl等耐受性测定、明胶液化、牛奶凝固与胨化、硫化氢试验、黑色素的产生、接触酶试验、碳源的利用等方面进行的。

2结果与讨论

 从浙江农林大学东边树林分离到1株降解菌，为X1。从甘薯废弃物周围共分离到1株降解菌，为X2。从浙江农林大学官塘共分离到2株降解菌，分别为C1、G2。从浙江农林大学后山共分离得到3株降解菌，分别为HS1、HS2、HS3。从杭州西湖分离到3株降解菌，分别为XH1、XH2、XH3。从这五个地方分离纯化得到的降解菌的菌落特征见表1。

2.1菌株初筛结果

 土样经分离纯化后共得到10株能在羧甲基纤维素钠琼脂培养基上生长并形成典型菌落的菌株。经刚果红染色后，有4株菌落周围产生了水解圈，各菌株的水解圈的情况见表2所示，可知X1菌株的D/d值最大为2.04，X2菌株的D/d次之为1.36，但是X2菌株的水解圈相对于X1菌株的较清晰。经碘液染色后，有7株菌落周围产生了水解圈，各菌株的水解圈情况见表3所示，可知X1菌株与X2菌株的D/d值的较大，分别为1.71和1.68。

 因此，通过纤维素水解圈与淀粉水解圈的初筛结果，选定X1菌株与X2菌株进行发酵菌种的复筛。

2.2甘薯渣发酵菌种复筛结果

 X1菌株与X2菌株随着发酵时间的增加，降解甘薯渣产低聚糖的量先增加后减少，这可能与微生物的生长曲线和分解代谢有关，微生物生长到一定阶段会进入稳定期与衰亡期，还有微生物分解代谢到一定阶段，会消耗发酵液中的低聚糖。X1菌株在发酵时间为96 h时，发酵液中低聚糖产量最高，可达51.261μg/m L，而X2菌株在发酵时间为72 h时达到高峰期，其低聚糖产量为41.792μg/m L。见图1。

 因此，最终选定Xl菌株为本研究的目标发酵菌株。

2.3菌株形态的初步鉴定

2.3.1  X1菌株形态特征

 X1菌株接种在高氏I号培养基上培养，菌落呈奶白色，单菌落圆形，表面干燥呈粉状。

 基内菌丝为浅黄色，气生菌丝为白色。在电镜下可观察到其气生菌丝分枝状无横隔，直径约0.6μm，孢子链呈直行状，有断裂无膨大（见图2），孢子呈椭圆状，表面有刺（见图3）。

2.3.2菌株的培养特征

  X1菌株在供试的大多数培养基上不产生可溶性色素并且生长情况良好，在高氏I号合成培养基上生长较好，培养5d后其单菌落直径可达4 mm，而在马铃薯浸汁琼脂培养基上生长较差。气生菌丝白色、浅黄色或淡灰色，基内菌丝深黄色、浅黄色或黄色(见表4)。

2.3.3生理生化鉴定结果

 通过对筛选菌株的生理生化鉴定结果可知，X1菌株的最适pH的范围为4～8，而此菌株在pH为2～4和8～12都不能生长。X1菌株的最适温度的范围为20℃~40℃，而此菌株在温度在10℃~20℃和40℃～50℃生长缓慢。X1菌株对Na Cl的最高耐受性为5%，而此菌株在浓度0，1%和3%的液体培养基中生长较好，但此菌株在浓度超过5%的液体培养基中不能生长，因此X1菌株的耐盐性较差。

 X1菌株不能使明胶液化，不能使牛奶凝固与胨化，能产生硫化氢气体，有黑色素的产生，可产生接触酶。在碳源利用方面，它利用葡萄糖、肌醇、壳聚糖、D-甘露糖、纤维二糖和柠檬酸三钠较好，而不能利用D-果糖、D-半乳糖、麦芽糖和D-木糖。

 参照《链霉菌鉴定手册》，结合形态特征、培养特征和生理生化试验结果，初步判定菌株WG25为链霉菌属白孢类群。

3结论

 通过试验中纤维素水解圈与淀粉水解圈对其进行初筛、测定发酵液中低聚糖产量进行复筛。最终确定自然界中获得的降解菌株X1为更适合甘薯渣发酵制备低聚糖的菌株。再通过对X1菌株的形态特征、培养特征和生理生化等鉴定并参照《链霉菌鉴定手册》，初步判定菌株X1为链霉菌属白孢类群。以甘薯渣为原料利用自然届菌株降解制备低聚糖，能够对甘薯渣进行资源化利用，成本低，污染少，可行性强，可对其生产工艺进行深入的研究和利用，这不仅能提高薯类作物的利用率和经济效益，还能减少了环境污染及资源浪费等问题。