高飞
中国食品药品检定研究院（北京100050）
摘要试验用二氧化氯(ClO2)溶液对已接种沙门氏菌和单增李斯特氏菌的黄瓜进行浸泡处理，研究ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度和处理时间这3个因素对杀菌效果的影响，并利用中心组合试验设计(CCD)建立这3个因素与杀菌效果之间的数学模型。研究表明，随着ClO2溶液质量浓度和温度增大，杀菌效果提高，处理时间延长能提高杀菌效果，但上升趋势随时间延长变得平缓。ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度和处理时间对沙门氏茵和单增李氏菌的杀菌效果均有极显著影响，且3个因素彼此之间交互作用显著。对沙门氏菌和单增李斯特菌杀菌效果的影响顺序分别为ClO2溶液温度>处理时间> ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度≥ClO2溶液质量浓度>处理时间。ClO2对沙门氏菌和单增李斯特菌杀菌效果的数学模型预报值与实测值基本一致，相对误差分别为1.20%和1.64%，建立的数学模型能描述-ClO2对黄瓜中沙门氏菌和单增李氏菌的杀菌规律，并能准确预测杀菌效果。
关键词二氧化氯；沙门氏菌；单增李斯特氏菌；黄瓜；杀菌效果
二氧化氯( ClO2)是目前国际上公认的一种高效的果蔬表面化学杀菌剂和食品保鲜剂。ClO2可以防止乙烯生成，杀灭果蔬表面的腐败菌来达到长期保鲜，而且经ClO2处理的果蔬，其风味以及外观品质不受到影响。相比于传统化学杀菌剂如氯气、双氧水等，ClO2氧化能力高、渗透能力和溶解能力高、反应后不生成有害物质、不产生异味，其应用前景十分广泛。沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，摄入了含有大量沙门氏菌属的食品后，人体会产生恶心、呕吐、腹痛、头痛和腹泻等。单增李斯特氏菌能在低温、低pH和干燥环境中生长，是一种病死率极高的食源性人畜共患致病菌。试验研究了ClO2对黄瓜中单增李斯特氏菌和沙门氏菌的杀菌效果，以期为果蔬保鲜提供另一途径。
1 材料和方法
1.1原料
黄瓜：市售；沙门氏菌Salmonella typhimuriumLT2：中国药品生物制品检定所；单增李斯特氏菌NICPBP54002：中科院微生物研究所；ClO2缓释剂：泰安嘉纳利环保科技有限公司；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂( TSA-YE)培养基：上海铭博生物科技有限公司；PALCAM琼脂：上海信帆生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、蒸馏水等：实验室提供。
1.2试验仪器与设备
YXQ-LS-50SII全自动高压灭菌锅：济南奥诺生物工程有限公司；AUW220D分析天平：日本岛津公司；HMGZT02洁净工作台：广东鸿茂净化设备实业有限公司；LRH-100-M生化培养箱：上海甄明科学仪器有限公司；JHX3H漩涡振荡器：北京京辉凯业科技有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；移液枪：北京誉朗诺科技有限公司；lDHG-9245A恒温鼓风干燥箱：上海越众仪器设备有限公司；BCD-271TMCN冰箱：海尔集团。
1.3试验方法
1.3.1 ClO2溶液的配置
准确称取0.250 g ClO2缓释剂，无菌水60℃溶解，定容于已灭菌的100 m L容量瓶中，制得ClO2母液。用丙二酸碘量法测定ClO2含量。
1.3.2沙门氏菌和单增李斯特氏菌菌悬液的制备
沙门氏菌和单增李斯特氏菌于无菌环境中分别 接人TSB-YE培养基和营养肉汤培养基（蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化钠5.0 g、蒸馏水1 000 m L、pH 7.4)，37℃振荡培养12 h，5 000 r/min离心5 min，除去培养基。无菌磷酸盐缓冲液洗脱菌落。GB 4789.2-2010进行平板菌落计数。稀释菌液，调整两种菌悬液的浓度分别都约为8 log CFU/m L。
1.3.3黄瓜表面接种
黄瓜使用前于4℃冰箱中贮藏。使用时先将黄瓜 分组并编号，无菌脱脂棉蘸取75%酒精擦拭黄瓜表面，之后用无菌刀于超净工作台内横切取10 +1 g，温度恢复至室温，紫外照射30 min。再用移液枪吸取10μ L稀释后的菌悬液均匀多点涂布在黄瓜表面，于超净台中风干30 min。黄瓜表面最终菌落数约为6 logCFU/m L。
1.3.4 ClO2溶液对接种黄瓜表面菌的处理与浸泡液中
残留菌的检测
在无菌环境中，将接菌后的黄瓜（沙门氏菌和单增李斯特菌）立即放于200 m L ClO2溶液中浸泡，处理一段时间后，放入含30 m L灭菌生理盐水的无菌匀质袋中拍打2 min，之后按GB 4789.2-2010进行平板菌落计数。计数方法：选择适宜稀释度，之后用灭菌生理盐水进行稀释。取100 VL的稀释液进行涂布，沙门氏菌试验组涂于营养琼脂培养基（蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1 000 μL、pH 7.4)上，单增李斯特菌试验组涂于PALCAM琼脂平板上，平皿放在37℃恒温培养温箱内培养24 h，计算平板内的菌落数目，再乘以稀释的倍数，就可以得到菌落总数。每个稀释度做3个平行。同时设置自来水对照组，即用自来水浸泡黄瓜作为对照组。
1.3.5杀菌效果的评价
杀菌效果采用ClO2处理前后菌体数量对数的差值
2结果与分析
2.1 ClO2溶液质量浓度对食源性致病菌杀菌效果的影响
黄瓜的接菌量为6.20±0.102 log CFU/m L，CIO2溶液温度为20℃，分别在ClO2溶液质量浓度为0，10，20，30，40和50 mg/L条件下，对黄瓜进行了10 min的处理，观察不同浓度ClO2的杀菌效果，结果如图1所示。从图1可看出，ClO2溶液质量浓度为0 mg/L（即自来水对照组）冲洗黄瓜后，单增李斯特菌和沙门氏菌均有所减少，但减少程度不明显。而ClO2溶液质量浓度对单增李斯特菌和沙门氏菌均有明显杀灭效果，随着ClO2溶液质量浓度的增大，杀灭效果更强，这可能是因为ClO2溶液质量浓度提高使得ClO2和菌体表面接触机会提高，有利于其发挥杀菌作用。ClO2溶液对沙门氏菌的杀灭效果强于单增李斯特菌，因为对于沙门氏菌，当ClO2溶液质量浓度为40 mg/L时，杀菌量达到最大为5.72 log CFU/m L，ClO2溶液质量浓度增大至50 mg/L时，已发挥不了作用；而对于单增李斯特菌，当ClO2溶液质量浓度为50 mg/L时，杀菌量才达到最大为4.96 log CFU/m L，为了保证食用安全性，通常情况下ClO2溶液质量浓度不应超过50 mg/L。
2.2 ClO2溶液温度对食源性致病菌杀菌效果的影响
黄瓜的接菌量为6.20±0.102 log CFU/m L，ClO2溶液质量浓度为40 mg/L，分别在ClO2溶液温度为0℃，5℃，10℃，15℃，20℃，25℃和30℃条件下，对黄瓜进行了10 min的处理，观察不同ClO2溶液温度的杀菌效果，结果如图2所示。从图2可看出，随着ClO2溶液温度升高，杀菌量逐渐提高。对于沙门氏菌，当ClO2溶液温度为25 ℃时，大部分已被杀灭；对于单增李斯特菌，当ClO2溶液温度为5℃～15℃，杀菌效果轻微提高，提高程度不明显，当ClO2溶液温度升到20℃时，杀菌效果大幅度提高，升到30℃时，杀菌量达到最大为5.64 log CFU/m L。在实际应用中，应跟随季节及真菌种类的变化适当调整ClO2溶液温度，保证ClO2的杀菌率。
2.3处理时间对食源性致病菌杀菌效果的影响
黄瓜的接菌量为6.20±0.102 log CFU/m L，ClO2溶液质量浓度为40 mg/L，在ClO2溶液温度为20℃条件下，分别对黄瓜进行了5，10，15，20，25和30 min的处理，观察不同处理时间的杀菌效果，结果如图3所示。从图3可看出，ClO2溶液处理时间不同，对沙门氏菌和单增李斯特菌的杀菌量不同，这可能是因为两种不同菌体表面与ClO2互作的位点有差异，所以对CIO2抗性有所不同。对于沙门氏菌，当处理时间由5min延长至15 min时，杀菌量明显提高至6.05 log CFU/m L，之后进一步延长处理时间但杀菌量增加缓慢，甚至不增加，这可能是因为处理时间的延长使得某些菌体发生应急反应，进而菌体抗性增加，导致ClO2
杀菌效果下降。对于单增李斯特菌，随着处理时间延长，杀菌量逐渐增大，当处理时间延长至25 min时，杀菌量达到最大为5.73 log CFU/m L，延长至30 min无法提高对单增李斯特菌的杀灭效果。在实际应用中，还应考虑较长时间浸泡可能会影响黄瓜的品质，因此应选择合理的杀菌处理时间。
2.4 ClO2对沙门氏菌杀菌效果的试验模型
2.4.1 中心组合试验设计
采用3因素3水平中心组合试验设计方法( CCD)研究ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度和处理时间对沙门氏菌杀菌效果的影响。杀菌试验的因素水平和结果分别见表1和2。
2.4.2 ClO2对沙门氏菌杀菌效果的数学模型
利用CCD建立的ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度、处理时间与杀菌效果之间的数学模型：杀菌量=
对数学模型的显著性和失拟性进行检验：失拟项的p=0.799 0，失拟检验不显著(p>0.05)，即模型适合；模型达到极显著水平( p<0.000 1)；回归方程具有较高的可信度。这说明了ClO2对沙门氏菌杀菌效果的模型和实际情况拟合度比较好，所以此模型可用于定量描述杀菌效果随CIO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度和处理时间的变化规律。
2.5 ClO2对单增李斯特菌杀菌效果的试验模型
2.5.1 中心组合试验设计
采用3因素3水平中心组合试验设计方法( CCD)研究ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度和处理时间对单增李斯特菌杀菌效果的影响。杀菌试验的因素水平和结果分别见表3和4。
2.5.2 ClO2对单增李斯特菌杀菌效果的数学模型
利用CCD建立的ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度、处理时间与杀菌效果之间的数学模型：杀 对数学模型的显著性与失拟性进行检验：失拟项的p=0.337 5，失拟检验不显著(p>0.05)，即模型适合；模型达到极显著水平( p<0.000 1)；回归方程具有较高的可信度。这说明了ClO2对单增李斯特菌杀菌效果的模型和实际情况拟合度比较好，所以此模型可用于定量描述杀菌效果随ClO2溶液质量浓度、CIO2溶液温度和处理时间的变化规律。
3结论与讨论
ClO2对黄瓜中的沙门氏菌和单增李氏菌均有很好的杀菌效果，随着ClO2溶液质量浓度和温度增大，杀菌效果提高，处理时间延长能提高杀菌效果，但上升趋势随时间延长变得平缓。
ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度和处理时间对沙门氏菌和单增李氏菌的杀菌效果均有极显著影响，且3个因素彼此之间交互作用显著。对沙门氏菌和单增李斯特菌杀菌效果的影响顺序分别为ClO2溶液温度>处理时间>ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度>ClO2溶液质量浓度>处理时间。CIO2对沙门氏菌和单增李斯特菌杀菌效果的数学模型预报值与实测值基本一致，相对误差分别为1.20%和1.64%，因此利用中心组合试验设计( CCD)建立的数学模型能描述ClO2对黄瓜中沙门氏菌和单增李氏菌的杀菌规律，并能准确预测杀菌效果。
ClO2溶液对于沙门氏菌和单增李斯特菌的作用结果是由ClO2溶液质量浓度、ClO2溶液温度和处理时间多种因素综合作用的。在实际生产应用中，需要同时考虑杀菌率和成本，因此可合理地调节ClO2溶液质量浓度、提高ClO2溶液温度或者延长处理时间来增强ClO2溶液杀菌的效果。CIO2具有无残留毒性、低成本的优点，是一种理想的果蔬杀菌保鲜剂，给现代果蔬安全质量的提高和延长货架期提供了新的发展方向。
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