LC-MS法测定四种果蔬中的有机酸

 刘晓雪1，张华2，张志丰1，王雪飞1*

 1．黑龙江东方学院（哈尔滨150086）；2．哈尔滨工业大学（哈尔滨150006）

摘要采用超高效液相色谱-质谱联用法对橘子、树莓、甘蓝和菠菜中的6种有机酸（酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸和马来酸）进行检测。选用ACQUITY UPLC~ HSST3色谱柱进行分离，0.1%甲酸／乙腈溶液-0.1%甲酸／水体系作为流动相进行梯度洗脱，流速为0.25 m L/min，选择ESI-多反应监测模式进行扫描。6种有机酸的平均回收率为77.9%~104.0%，相对标准偏差RSD值为2.0%~12.4%，相关系数R2>0.998 9，该方法的最低检出限的分别为0.02 mg/kg和0.05 mg/kg，最低定量限分别为0.1 mg/L和0.25 mg/L。准确、高效地测出了四种果蔬中有机酸的含量。

关键词超高效液质联用仪；有机酸：果蔬

 果蔬中有机酸的含量和种类对果实的品质以及食用时人的口感风味有着重要影响…。有机酸是人体活动过程中不可少的成分，大多数有机酸可直接参与生命活动，而有机酸的性质、结构以及含量的多少对人体的健康有着很重要的作用。有机酸可促进钙、铁离子的吸收、提高机体免疫力、促进人体内的新陈代谢以及改善内分泌失调等作用。如今国内外关于果蔬中有机酸的检测方法已有很多，方法也比较成熟，例如比色法、滴定法、分光光度法、荧光法、薄层色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、气相色谱法、气质谱联用法和高效液相色谱法等，这些检测方法的适用范围受限，受杂质干扰严重，灵敏度低，前处理方法复杂，分析检测范围窄等不足。因此，研究建立了LC-MS法测定果蔬中的有机酸来改善以上检测方法的不足，建立一个灵敏度高、检测范围广、检出限低的检测方法。

1  试验材料与方法

1.1试验材料

 饮用纯净水：黑龙江省虎林哇哈哈饮料有限公司；甲酸、乙腈：色谱纯，纯度为98%，Fluka有限公司；乙醇：色谱纯，纯度为90%，Fluka有限公司；异丙醇5%、甲醇5%;磷酸：分析纯，纯度为98%，天津市天力化学试剂有限公司；甲醇：

色谱纯，纯度为99.9%，上海SIGMA-ALDRICH

1.2仪器与设备

 ACQUITY UPLC XEV0 7G超高效液相色谱-质谱联用仪：美国Waters公司；ACQUITY UPLC~ HSS T3色谱柱：美国Waters公司；电子天平：METTLERTOLEDO公司；GX-274固相萃取装置：GILSON公司；IKA RV10旋转蒸发器：德国IKA公司；MTN2800D氮吹仪：OA-SYS公司；IKA MS3旋涡混匀器：德国IKA公司；2094组织捣碎机：FOSS公司；T25均质机：德国IKA公司；L550离心机：湘仪离心机有限公司。

1.3试验方法

1.3.1流动相的配制

 流动相A（0.1%甲酸-乙腈溶液）：取300μL甲酸溶液再向其中加入乙腈溶液至300 m L，过0.22μm尼龙油膜抽滤，混匀即可。

 流动相B（0.1%甲酸-水溶液）：取300μL甲酸溶液再向其中加入饮用纯净水溶液至300 m L，过0.22 μm尼龙水膜抽滤，混匀即可。

 流动相C（弱洗溶液）：取30 m L饮用纯净水溶液再向其中加入270 m L乙腈溶液，过0.22 μm尼龙油膜抽滤，混匀即可。

 流动相D（强洗溶液）：取270 m L饮用纯净水溶液再向其中加入30 m L乙腈溶液，过0.22μLm尼龙油膜抽滤，混匀即可。

1.3.2  有机酸标准储备溶液

 分别称取0.01 mg的柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸和马来酸；用饮用纯净水充分溶解，再定容到100 m L。柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸和马来酸的质量浓度分别为100 μg/m L，此溶液为标准储备液。分别吸取上述储备溶液1 m L用饮用纯净水定容到100 m L，各有机酸质量浓度为1μg／m L，作为使用标准溶液。在±4℃的温度下储存。

1.3.3  仪器条件

1.3.3.1色谱条件

 T3色谱柱，流动相为0.1%甲酸／乙腈溶液-0.1 %甲酸／水体系，流速为0.25 m L/min，柱温为50℃，进样体积为5μL。流动相采用梯度洗脱的形式进行试验，最终得到最佳梯度洗脱条件（见表1）。

1.3.3.2质谱条件

 电喷雾离子源( ESI)，负离子扫描模式，多反应监测，样品室温度为5 0C，毛细管电压为2.5 kV，锥孔电压为20 V，射频透镜为0.1 V，离子源温度为150 0C，脱溶剂温度为450℃，脱溶剂气流量为650L/h，锥孔气流速为50 L/h，毛细管气流速为0.22 m L/min。通过以上质谱条件对目标化合物的离子对进行摸索，最终确定各种目标化合物的离子对条件(见表2)。

1.3.4  样品的制备

  称取400.0 g果蔬样品放入均质机中进行搅碎，将其作为储备样品使用。称取上述试验样品3.00 g于离心管中，再向其中加入30 m L饮用纯净水，进行均质提取后，放入离心机中以3 000 r/min离心4 min分-出上清液，放入100 m L容量瓶中。残渣再用30 m L饮用水进行上述提取然后合并上清液于容量瓶中，用乙醇定容到刻度线，混匀，作为提取溶液。过滤出5 m L清液于鸡心瓶中，用旋转蒸发仪在80℃下进行蒸干。再用5 m L的5%磷酸-水溶液定容，用旋涡混匀器混匀，然后过6 m L SAX固相萃取柱。先用5 m L甲醇、5 m L水进行活化SAX固相萃取柱，活化结束后将5%磷酸-水溶液定容的样液加入到SAX柱内，待样液过柱后，用5m L水、5 m L甲醇淋洗，再用5%磷酸-甲醇洗脱，收集5 m L的5%磷酸-甲醇洗脱液于试管中，N2吹至近干。用1mL流动相进行定容，旋涡混匀器混匀，过0.22μm水膜于进样瓶中，待测。

2结果与讨论

2.1线性范围和方法检出限

 将质量浓度范围为0～2 000 μg/L的六种有机酸标准储备液(1.3.2)分别由低浓度向高浓度注入到超高效液相色谱-质谱联用仪中得到不同有机酸标准溶液的峰面积( Area)。以有机酸对照品溶液的峰面积为纵坐标，有机酸对照品溶液质量浓度( mg/L)为横坐标制作标准曲线，计算回归方程和线性系数。

 结果发现在0～1 000 μg/L范围内富马酸和马来酸线性关系较好，在0～2 000ILg/L范围内苹果酸、柠檬酸、酒石酸和琥珀酸的线性关系较好。相关系数R2达到0.998 9～0.999 8。最低检出限的分别为0.02 mg/ kg和0.05 mg/kg，最低定量限分别为0.1 mg/L和0.25 mg/L

（见表3）。

2.2  回收率和精密度

 向甘蓝和树莓样品中分别添加6种有机酸的混合标准品后按照(1.3.4)的步骤进行回收试验的验证，加入的混合标准品的质量浓度分别为0.2，0.5和1μg/m L，每个加标浓度都进行6次平行试验。

 结果证明甘蓝在不同浓度下的平均回收率的范围为81.1%～102.2%之间，相应的RSD值范围是2.0%，7.3%（见表4）。树莓在不同浓度下的平均回收率的范围为77.9%~104.0%之间，相对标准偏差RSD值的范围为2.5%~12.4%之间（见表5）说明该试验的回收率和精密度较好。

2.3稳定性和准确度

将添加过标准品的样品（质量浓度为1μg/m L）于4℃条件下冷藏，第3天测定样品峰面积的变化，第6天测定样品峰面积的变化，测定时每个样品重复进样6次，通过峰面积的响应值来比较样品的稳定性以及准确度。

  存储过的加标样品上机测定结果如图1所示，六种有机酸色谱图的峰面积值在第3天与第6天几乎无明显变化，相对标准偏差RSD值的范围在1.29%~9.99%之间，说明该试验方法的稳定性和准确度较好。

2.4样品测定

 研究选用了橘子、树莓、甘蓝和菠菜进行6种有机酸的测定，试验方法按(1.3.4)进行处理样品。 

结果证明水果蔬菜中所含的有机酸各不相同，每种有机酸的含量也不同。4种果蔬的测定结果(见表6)。橘子、树莓、甘蓝和菠菜4种果蔬中都含有苹果酸，无琥珀酸、马来酸和富马酸。4种果蔬中除了含有苹果酸外，橘子和菠菜中含有柠檬酸，树莓中含有柠檬酸和酒石酸。

3结论

 研究建立了超高效液质联用法测定4种果蔬中的有机酸。有机酸标准溶液的谱图和4种果蔬样品的谱图见图2～6。由图可知，有机酸标准溶液能达到很好的分离效果，而且样品杂质能与有机酸很好的分离，准确测定出4种果蔬中有机酸的成分以及含量。说明LC-MS法能准确、快速地测定果蔬中的有机酸。