HPLC-ELSD法测定木薯中单糖的含量

 吴晓鹏，李玖慧，唐嘉，易小平*

1．中国热带农业科学院热带生物技术研究所（海口571101）：2．农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室（海口571101）

摘要采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定木薯中果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖的含量。样品用水经超声波提取，用Xbridge-NH2色谱柱分离，流动相为乙腈：水（水中加入0.2%的三乙胺）的体积比为70：30，流速为1.0m L/min，Elsd漂移管温度为85℃，氮气流速2 L/m/n。在该条件下果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖得到很好的分离，分别在1.5~ 25，1.5-25，2～25和1.5-25 μg的范围内有良好的线性范围，相关系数R分别为0.999 1，0.999 1，0.999 0和0.999 3，最低检出限分别为6.50，5.50，4.00和7.00 mg/kg，加标回收率分别为97.6%, 98.6%，96.2%和95.4%。验证试验结果表明，该方法快速、准确，能用来测定木薯中单糖的含量。

关键词  高效液相色谱一蒸发光散射检测；木薯；单糖

 木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科( Euphorbiaceae)木薯属，又名木番薯、树薯…，主要分布在巴西、尼日利亚、泰国和中国等100多个国家的热带地区，我国木薯种植主要分布在海南、广西、广东、福建和云南等地。木薯是世界上三大薯类作物之一，具有“地下粮仓”、  “淀粉之王”和“特用作物”的美誉，目前，木薯的用途主要是食用、饲用和工业开发利用这三方面，鲜薯主要用作于淀粉加工和酒精原料，也是世界公认的具有发展潜力的可再生能源。木薯是我国最主要的生物乙醇的主要原料之一，也是我国第一种实现封闭运行的非粮原料乙醇。

  糖在生物体内普遍存在，是自然界分布最广泛、数量最多的有机物。糖在生物体内的转运直接影响到植物的生理活动。目前糖含量测定方法有化学法、高效液相色谱法等，化学方因其准确性低，只能测定还原性总糖，无法对具体还原性糖进行定性和定量分析。因此，试验通过高效液相色谱一蒸发光散射检测法测定木薯中单糖的含量，建立木薯中果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖的测定方法，为木薯的开发利用提供参考。

1  材料与方法

1.1材料与仪器

 木薯：中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供，水果木薯、华南124号、华南9号木薯、华南8号木薯和阿根廷7号木薯共5个品种，在根块膨大期分别取块根、茎和叶三个部位。

 果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖标准品：Sigma公司；乙腈：色谱纯；乙醇：分析纯；超纯水：电阻率为18.2MΩ ．cm,三乙胺：分析纯；高纯氮气。

 Waters e2695高效液相：Waters公司；3300 ELSD蒸发光检测器：美国格蕾斯有限公司；AL104型电子天平：梅特勒一托利多（上海）有限公司；KS-8892型超声波提取仪：宁波海曙科生超声设备有限公司；2323K型离心机：德国Hermle公司。

1.2色谱条件

 色谱柱：Xbridge-NH2柱(250 mm'4.6 mm，3.6μm)：美国Waters；流动相为乙腈：水（水中加入0.2%的三乙胺）体积比为70：30；柱温：30℃；ELSD漂移管温度85℃，载气N2流速：2L/min。

1.3溶液的制备

1.3.1标准品溶液的制备

 精密称取4种糖标准品各20.00 mg，分别至于5 m L容量瓶中，加入50%乙腈-水溶剂定容，摇匀，即得质量浓度为4.00 mg/m L的4种糖的标准溶液。

1.3.2供试样品溶液的制备

 木薯新鲜样品，加入液氮研磨成粉末，精密称量2 g+ 0.000 1 g左右，置于100 m L三角瓶内，加入800/0乙醇溶液50 m L，采用超声波提取法超声30 min，静置后离心10 min，取上清液80℃烘干乙醇，加入乙腈一水（50：50，V:V）溶剂定容至10 m L，用0.45 μm有

机相膜过滤2～3次后待测。

1.4标准曲线的制作

 取标准品溶液适量，配成质量浓度分别为2.50，2.00，1.50，1.00和0.50 mg/m L的系列标准溶液，进样量为10μL，每个质量浓度作3次平行测定。以标准品峰面积为Y纵坐标，进样量X（μg）为横坐标，绘制标准曲线。

1.5精密度、加标回收率和稳定性试验

1.5.1精密度试验

  取一份木薯样品，按照1.3.2方法制备溶液，平行进行测定6次，进样量为10μ1进行测定，比较4种糖的峰面积。

1.5.2稳定性试验

 取一份木薯样品，按照1.3.2方法制备溶液，分别在0，4，8，16和24 h进行测定，进样量为10 μL进行测定，比较4种糖的峰面积。

1.5.3加标回收试验

 取同一木薯样品叶片12份，分成4组，每组3个平行，分别加入果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖各5 mg，按照1.3.2方法制备溶液，进样量10μ L，计算平均回收率。

2结果与讨论。

2.1流动相的选择

 选用Waters Xbridge-NH2色谱柱，以流动相为乙腈-水考察糖类化合物在氨基柱上的分离情况，结果表明，提高流动相中水的比例可以缩短分离时间，但会使分离度下降，果糖与葡萄糖的峰部分重叠，而且水的比例过大会造成氨基柱的损伤；降低流动相中水的比例可以使分离度变大，但分离时间延长，峰宽严重。综合考虑以上因素，当流动相：乙腈-水( 70：30，V: V)，流速为1 m L/min时，分离效果令人满意。柱温设为室温30℃。氨基柱使用过程中，pH调节剂通常为氨水或三乙胺，因为氨水易挥发，在检测过程，pH发生变化，糖类化合物在氨基柱上的分离效果也没有三乙胺的效果好，因此，选择在水相中加入0.2%的三乙胺。

2.2  ESLD参数的选择

 ELSD检测器的参数主要有漂移管温度和载气流速。漂移管温度影响检测器的响应，温度低时流动相蒸发不完全，温度升高，流动相蒸发趋于完全，信噪比提高，但温度过高会使流动相沸腾，增加背景噪音，还可导致组分部分汽化，信号响应值变小，最优温度为在流动相基本蒸发完全的基础上，产生可以接受的噪音的最低温度，应根据流动相选择合适的漂移

管温度。

 一般来说，载气流速越小，形成的溶质颗粒越大，散射光的强度越大，但是当载气流速太小时，流动相蒸发不完全，背景噪音大，最优的载气流速应是在产生可接受噪音的基础上，产生最大响应值的最低流速。以推荐值为起点，逐渐改变漂移管温度或载气流速，观察基线噪音和响应信号的大小。结果发现，当漂移管温度为85℃，氮气流速为2 L/min，噪音最小，响应信号最强，故确定此条件为最佳条件。

2.3线性范围和最低检出限

 在相同的色谱条件下，分别以相同浓度不同进样体积的标准溶液进行分析，测定峰面积与相应糖的含量进行线性回归，以10倍信噪比（S/N）计算方法检测低限。分析结果表明，线性关系良好，保留时间分别为6.083，6.618，8.354和9.970 min。标准品和样品的色谱图分别为图1(A)和图1(B)。各标准品的回归方程、线性相关系数和最低检出限结果见表1。

2.4精密度试验

 制备好的木薯样品溶液连续测定6次，四种糖的峰面积RSD值分别为1.72%，1.67%，1.84%和2.33%，结果显示精密度良好。

2.5稳定性试验

  制备好的木薯样品溶液，分别在0，4，8，16和24 h进行测定，4种糖的峰面积的RSD值分别为0.88%，0.48%，1.05%和1.91%，表明果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖在24 h内稳定。

2.6加标回收率试验

试验结果如表2所示，表明该方法的回收率良好。

2.7样品测定

 样品结果分析如表3所示，华南124号木薯叶片中葡萄糖含量最高，华南8号木薯叶和阿根廷7号木薯叶蔗糖含量较高；华南8号木薯茎中葡萄糖含量较高，其他品种茎部各个糖含量差异不大；所有品种的块根中蔗糖含量最高。试验结果与已发表的相比较，发现海藻糖的含量在叶片不同时期差异较大。

3结论

  试验结果显示，采用超声波水提法提取木薯中的单糖有较高的提取率。高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定木薯中的单糖具有准确度和灵敏度高的特点，可以用于木薯中单糖含量的测定。膨大期的木薯叶量达到生长期的最高峰，通过此方法测定此时的木薯不同部位的糖含量，为木薯的综合利用开发提供基础。