鮟觫皮胶原蛋白肽最佳制备工艺及自由基清除活性研究

 邵宏宏，周秀锦，相兴伟，张静，傅谧妮

 舟山出入境检验检疫局（舟山316000）

摘要研究提取鮟鱇(Lophius litulon)胶原蛋白肽的最佳制备工艺，测定鱼皮基本成分和多肽的氨基酸组成，探讨鮟鱇胶原肽组分体外对自由基的清除效果。研究结果表明，鱼皮中粗蛋白占28.1%，胃蛋白酶添加量1%，料液比1：20 (g/m L),酶解时间6h，酶解温度5℃时，提取的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的H yp（羟脯氨酸）提取率为11.46%；鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽中Gl y（甘氨酸）占36.61%, Pro（脯氨酸）和H yp总含量占16.86%, P he（苯丙氨酸）、C ys（半胱氨酸）、His（组氨酸）三者含量不及1%；鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽具有较强的还原能力且对O2-.（超氧阴离子自由基）、. DPPH(二苯基苦酰肼自由基自由基）、. OH（羟自由基）自由基具有清除效果，且自由基清除能力随着鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的浓度升高而增强，鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽浓度为10 mg/m L时对．OH，DPPH．，O2-．的清除率和还原力分别为70.48%, 68.78%, 42.53%和0.676%。

关键词  鮟鱇鱼；胶原蛋白肽；氨基酸；自由基；抗氧化；羟脯氨酸

  鮟鱇鱼（Lophius litulon）属冷温性底层鱼类，常栖伏海底，分布于北太平洋西部，我国产于东海北部、黄海及渤海。近年来我国鮟鱇鱼出口需求旺盛，产量和价格大幅增加，鮟鱇鱼出口已成为我国的新兴渔业。然而，在鮟鱇鱼的加工中，大量鱼皮被做为下脚料而废弃，这不仅污染环境，而且浪费资源。

 研究证实人体内氧化产生的自由基与人的衰老、癌症、动脉硬化等许多疾病有关，其中尤以氧自由基最多，在机体内过多的自由基可损伤生物大分子，影响细胞的正常结构和功能。目前，已有研究报道水产动物提取多肽具有体内外抗氧化活性，并显示了具有较好应用前景。

 试验研究了鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽对自由基的清除作用以及体外抗氧化作用，以探索实现鮟鱇皮的高值化加工利用途径。以鮟鱇鱼皮为原料，研究鱼皮成分组成，通过正交试验酶解制备鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽，分析胶原肽氨基酸组成。通过铁离子还原体系和具有代表性的O2-．，DPPH．和．OH三种自由基体系的试验，研究鮟鱇鱼皮多肽体外对自由基的清除效果。

1  材料与方法

1.1材料与仪器

 鮟鱇鱼原料：由舟山兴业有限公司提供，原料去肉，去除杂物，于-18℃冷藏；胃蛋白酶：比活力1：3 000，上海源聚科技生物有限公司；其他的试剂为国产分析纯。

 Micct-Q型超纯水器：日本Milli-por LIMITED公司；EYELA冷冻干燥机：上海爱朗仪器有限公司；CR21G高速冷冻离心机：HITACHI CENTRIFUGE；AL-104电子分析天平：梅特勒一托利多仪器有限公司；日立835-50氨基酸自动分析仪：日本日立公司；UV-2102 C型紫外分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；SK21-4型数显水浴锅：天津欧诺仪器公司；海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司。

1.2试验方法

1.2.1鱼皮基本组成成分测定

  水分：直接干燥法测定；灰分：高温炉550 0C灼烧法测定；粗蛋白：微量凯氏定氮法测定；粗脂肪：索氏脂肪抽提法测定；总糖：苯酚硫酸法测定。

1.2.2鱼皮胶原蛋白肽的制备

 11最佳胃蛋白酶添加量的确定：试验固定料液比1：20( g/m L)，酶解时间6h，酶解温度5aC，胃蛋白酶添加量分别取0.5%，7.0%，1.0%，1.5%，2.0%．2.5%和3.0%。

 2)料液比的确定：试验固定胃蛋白酶质量分数1%，酶解时间6h，酶解温度5℃，料液比分别取1：5,1: 10,1:20,1:25和1:30( g/m L).

 3)酶解温度的确定：试验固定胃蛋白酶质量分数1%，料液比1：20( g/m L)，酶解时间6h，酶解温度1 ℃,5℃, 10℃,15℃,20℃和22℃。

 41酶解时间的确定：试验固定胃蛋白酶质量分数1%，料液比1：20( g/m L)，酶解温度50C，酶解时间1，2，3，4，5，6和7h。

 5)鱼皮胶原蛋白肽的制备条件：通过正交试验，确定工艺流程。新鲜鱼皮预处理（0.1 mol/L Na OH辅以磁力搅拌24 h，蒸馏水洗至中性，10%丁醇浸泡24 h，洗至中性）→0.5 mol/L醋酸浸提24 h→0.9 mol/L Na Cl盐析24 h→蒸馏水透析(料液比为1：15(g／m L)) →沉淀得ASC→酶水解(胃蛋白酶质量分数1%，料液比为1：20( g/m L )，酶解时间6h，酶解温度5℃）→过滤→浓缩→产品冻干保存。

1.2.3羟脯氨酸标准曲线的制作

 按照IS0 3496: 1978 (E)方法，略有修改。羟脯氨酸标准品用蒸馏水稀释为1，2，2.5，3，3.5，4和4.5μg/m L，以对二甲基氨基苯甲醛为显色剂，以羟脯氨酸的浓度为横坐标，测定不同浓度的羟脯氨酸的A560值为纵坐标，绘制羟脯氨酸的标准曲线，结果见图1，羟脯氨酸标准样品的回归方程为Y=11.710 8X-3.531 6(R2=0.995 3)。

1.2.4 H y p提取率计算

  称取1.0 g鮟鱇鱼皮粉，加入50 m L浓度为6 mol/L的盐酸，105 0C鼓风干燥箱中密封水解24 h，用蒸馏水定容至100 m L。准确移取1 m L该水解液，用Na OH溶液调节pH至6.0后蒸馏水定容至100 m L，按1.2.3方法测定羟脯氨酸含量，计算出鱼皮中羟脯氨酸总含量，量取10 m L胶原蛋白提取液，按上述方法测定提取液中羟脯氨酸的含量，计算羟脯氨酸的提取率。

 H yp提取率=提取液中H yp总含量(%)，鱼皮原料中H yp总含量(%) (1)

1.2.5鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的氨基酸组成测定

 称取一定量的冻干的鮟鱇鱼皮多肽，加入6 mol/LHC1后真空封管，置110℃烘箱密封水解24 h后抽真空赶酸，定容至0.5 m L，氨基酸自动分析仪测定各氨基酸的含量，进样量为50 μL。

1.2.6样品的抗氧化能力

 选取维生素C、茶多酚和BHA为对照样品，体外试验分别设置的浓度梯度为2，4，6，8和10 mg/m L。

1.2.6.1样品的还原能力测定

 取一定浓度的样品，加入2.5 m L  pH 6.6的磷酸盐缓冲液( 0.2 mol/L)和2.5 m L体积分数1%的铁氰化钾溶液，混匀，在50℃保温20 min后加入2.5 m L 10%的三氯乙酸，混合后以3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 m L，加蒸馏水2.5 m L和0.5 m L，质量分数为0.1%的FeCl3，用A700nm波长处测定的比色值(ABS)表示样品还原能力。

1.2.6.2样品清除超氧阴离子自由基能力测定

 采用邻苯三酚自氧化法，邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化，生成有色中间产物和超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基对自氧化有催化作用。具体操作：取0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.2缓冲液4.5 m L，置25 0C水浴预热20 min，加0.1 m L不同浓度的样品，2.5 m mol/L邻苯三酚0.4 m L，混匀后在25℃水浴中反应4 min，立即用VC溶液终止反应，测A299nm值。以蒸馏水代替样品做空白组，按式(2)计算清除率并求得IC50。

1.2.6.3样品清除DPPH自由基能力测定

 采用DPPH酶标仪法，加不同浓度的样品溶液100 μL和1 m mol/L的DPPH自由基甲醇溶液100 μL于96孔酶标板中，振荡30 s，37℃保温20 min后在517nm波长下测定。每个样品平行测定3次。然后按公式(3)计算。

代替样品）的吸光度。

1.2.6.4样品清除羟自由基能力测定

 取0.025 mol/L，pH 7.4的磷酸缓冲液1 m L，40 μg/m L的番红花红1 m L，供试药品0.5 m L，3%过氧化氢1 m L（新鲜配制），0.945 m mol/L EDTA-Fe(Ⅱ)1m L（新鲜配制），混合后37℃水浴中反应30 min后，520 nm处测定吸光度。空白组以0.5 m L蒸馏水代替供试样品，对照组以1.5 m L蒸馏水代替EDTA-Fe(Ⅱ)和供试样品，按式(4)计算清除率。

2结果与分析

2.1鮟鱇鱼皮基本组成成分

  从表1可以看出，鮟鱇鱼皮的水分含量很高，约占总重的70%。粗蛋白约占28%，约为干物质总量的93%，粗脂肪的含量比粗蛋白相比较低。

2.2最佳处理条件的确定

2.2.1确定最佳胃蛋白酶添加量

 当胃蛋白酶添加量为0.5%时，胶原蛋白肽液中H y p的提取率最低，H y p的提取率随着酶添加量的增加而增加，在添加量为1.5%时，H y p的提取率最大，随后H y p的提取率下降，虽然胃蛋白酶添加量为1.5%时的 H y p提取率比1%时稍高，但酶用量较大。所以从纯度和经济方面考虑，1%的胃蛋白酶添加量应为最佳选择，试验结果如图2所示。

2.2.2确定最佳料液比

 当料液比为1：20( g/m L)时提取效果最好。随着料液比增加，鱼皮中H y p的提取率增加，但到一定程度后，鱼皮中H y p的提取率降低，故确定最佳料液比为1：20( g/m L)，试验结果如图3所示。

2.2.3确定最佳温度

 从图4中可以看出，胶原蛋白肽在5℃时酶处理效果最好，提取效果最好，过高或过低的温度都会影响酶的活性，从而影响酶处理效果，试验结果如图4所示。

2.2.4确定最佳时间

 试验结果如图5所示，当酶解时间为6h时提取效果最好。反应初期，酶解速率较大，胶原蛋白肽液中H y p的提取率上升，但到达一定时间后，酶失去作用力，含量不再上升，故确定最佳酶解时间为6h。

2.3最佳提取条件的确定

 由单因素试验的结果，以酶解时间、料液比、胃蛋白酶加酶量和温度为因素，H y p提取率为指标设计L9(34)正交表，以确定最佳工艺。试验结果见表2。

 正交试验极差(R)表明，对H y p影响最大的是酶解温度(D)，依次是料液比(B)，加酶量

(C)，酶解时间(A)，最佳提取组合为A3B3C2D1，即胃蛋白酶质量分数1%，料液比为1：20( g/m L)，酶解时间6h，酶解温度5℃。

 由表3可以看出，酶解温度对提取的胶原蛋白肽的H y p含量具有极显著影响，而料液比，酶解时间和加酶量有较小影响，优选组合应为A3B3C2D1，H y p含量为11.46%。

2.4氨基酸组成成分分析

  最佳酶解提取工艺条件下，鮟鱇鱼胶原蛋白肽的氨基酸组成和含量，如表4所示。

 鮟鱇多肽的氨基酸组分中G l y、Pro和H y p等的与其性质密切相关的氨基酸含量较高。与其他来源的鱼皮胶原蛋白一样，甘氨酸占36.61%，在鮟鱇胶原蛋白肽中含量最高，其中Pro和H y p的含量占16.86%，而P he、C y s和His含量极小，三者含量占有比例均不达1%。

2.5鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的紫外吸收光谱

 在200～400 nm的近紫外光区将提取的鮟鱇多肽进行全波长扫描，结果如图6。由图6可知，鮟鱇多肽在200～250 nm有紫外吸收，其最大的吸收波长为232nm。

2.6鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的抗氧化能力

2.6.1  鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的还原能力

 在低pH下，抗氧化剂将Fe3+还原成蓝色的Fe2+以Fe2+当量或者相对于标准抗氧化剂的能力来表示抗氧化活性。

 图7为不同抗氧化剂（鮟鱇胶原蛋白肽，VC，BHT和茶多酚）对Fe3+的还原能力。相同浓度条件下，鮟鱇胶原蛋白肽的还原能力介于VC和BHT之间，VC的还原能力最高。室温条件下，鮟鱇多肽的抗氧化活性随浓度增大而增强。

2.6.2鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽清除超氧阴离子的能力

  超氧阴离子是生物有机体代谢过程中产生氧化能力很强的自由基，为此可以测定抗氧化剂对其清除效率来表征样品的抗氧化能力。各种抗氧化剂浓度与自由基的清除率关系如图8可知，随抗氧化剂浓度的增加而对超氧阴离子清除率增大，其中胶原蛋白肽浓度为10 mg/m L时清除率为42.53%。

2.6.3鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽清除DPPH自由基的能力

  稳定自由基DPPH．乙醇紫色溶液在517 nm波长有较强的吸收峰值，抗氧化剂能使这一吸收现象消失，颜色褪化，因此通过衡量样品溶液吸光度的变化能够快速灵敏的评价抗氧化剂的抗氧化能力。浓度不同的抗氧化剂清除DPPH自由基的结果如图9所示，清除DPPH的能力均随浓度的增加而增大，胶原蛋白肽浓度为10 mg/m L时清除率可达68.78%。浓度相同时，抗氧化剂清除能力的大小依次为茶多酚>VC>多肽>BHT，因此可知多肽具有一定的的清除DPPH能力。

2.6.4鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽清除羟自由基的能力

  羟基自由基(．0H)是需氧生物代谢过程中生成的强氧化能力的氧自由基，因此以清除羟自由基能力来反应抗氧化性的强弱。不同抗氧化剂清除羟自由基能力如图10所示。不同抗氧化剂清除羟自由基的能力均随浓度的增加而增大，胶原蛋白肽浓度为10mg/m L时对自由基的清除率达70.48%，明显高于VC和BHT。不同抗氧化剂在浓度相同条件下，清除能力的大小依次为：多肽>茶多酚>BHT>VC。由此可知，鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽具有很强的清除羟自由基的能力。

3结论

 鮟鱇鱼皮中胶原蛋白是鱼皮蛋白的主要组成成分。其最佳提取工艺为胃蛋白酶质量分数1%，料液比为1：10( g/m L)，酶解时间6h，酶解温度5℃。鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的H y p提取率为11.46%。鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽的氨基酸组分中G l y，Pro，H y p等的与其性质密切相关的氨基酸含量较高。鮟鱇皮胶原蛋白肽具有还原能力和清除．OH．．DPPH和O2-·作用，随着浓度的增加清除率也相应增大。其样品浓度为10mg/m L时对．OH，．DPPH，O2-·的清除率和还原能力分别为70.48%，68.78%，42.53%和0.676%，相同浓度下，对．DPPH清除能力的大小依次为茶多酚>VC>多肽>BHT，对．OH清除能力的大小排列为多肽>茶多酚>BHT>VC。试验分析了鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽对自由基的清除作用以及体外抗氧化作用，为探索实现鮟鱇皮的高值化加工利用途径提供了可靠的依据。