大蒜美拉德反应过程中内源酶活性和抗氧化能力变化

 王卫东1.2，孙月娥1，2*，宋辰2，董艳花2

1．徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室（徐州221111）：2．徐州工程学院食品学院（徐州221111）

摘要  以大蒜为原料研究其在恒温恒湿度条件下进行美拉德反应过程中内源酶活性、多酚含量以及抗氧化能力的变化。结果表明大蒜美拉德反应分别进行到40 min，2h，30 min，1h，18 h时，大蒜中的PPO、POD、蒜氨酸酶、y-谷氨酰转肽酶和SOD的残余酶活已小于10%; 75℃，85%湿度处理12 d期间多酚含量一直增加；以还原能力，清除羟自由基能力，清除超氧阴离子自由基能力，清除ABTS+．能力，铁离子还原力反映的大蒜抗氧化能力也一直上升：大蒜

内源酶的热稳定性不同，但在发酵几小时后基本都失活。因此，美拉德反应后大蒜的抗氧化能力主要与多酚等活性成分含量有关，受内源酶影响较小。

关键词  大蒜；美拉德反应；酶活：抗氧化能力

  大蒜属于百合科草本植物，又被称为蒜、独蒜。大蒜中含有糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸以及维生素等多种营养成分，还含有PPO、POD、SOD、蒜氨酸酶和y-谷氨酰转肽酶等多种内源酶，以及多酚、硒和有机硫化物等多种活性成分。早在明代李时珍就发现大蒜虽然具有蒜臭味，但能够去除湿气和寒气，消肿止痛，促进肠道消化。现代研究表明大蒜具有降低胆固醇，防治癌症，降低血糖，抗氧化，美容，预防感冒和瘟疫，保护肝脏等功效。PPO和POD是生物体内抗氧化酶系统的重要保护酶，普遍存在于水果和蔬菜中，果蔬中的酚类物质在PPO和POD催化下，可作为底物被氧化，降低抗氧化能力。SOD是一种源于生命体的金属酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，是体内氧自由基的头号杀手，是人体健康之本。据报道，大蒜美拉德反应后制备的黑蒜相比新鲜大蒜，活性成分和抗氧化能力均增强。前期试验结果也表明大蒜美拉德反应后抗氧化能力增强，为加速大蒜美拉德反应进程，降低加工的时间成本和能耗，揭示大蒜美拉德反应过程中抗氧化能力增强与内源酶活，多酚等活性成分的关系，本试验对恒温恒湿条件下大蒜美拉德反应过程中内源酶活性和抗氧化能力变化进行研究，以期为大蒜的深加工提供理论支持。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

 新鲜大蒜：市售；无水乙醇，邻苯二胺，邻苯二酚，焦性没食子酸，邻苯三酚，邻二氮菲等：均为分析纯。

1.2仪器与设备

 HH-4型数显式电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；DS-1型高速组织搅碎机：上海标本模型厂制造；TU-1810PC型紫外分光光度计：北京普通用仪器有限公司；722G可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机：湖南湘仪精密仪器开发有限公司；JS-HS010恒温恒湿箱：上海隽思实验仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1  黑蒜制备

 新鲜大蒜→挑选→去蒂并剥去外层皮（留下三层皮）→放入密闭容器中于75℃，85%湿度下处理12 d

1.3.2酶活测定

 PPO酶活测定：邻苯二酚法；POD酶活测定：分光光度法；蒜氨酸酶活测定：丙酮酸法;y-谷氨酰转肽酶活测定：分光光度法；SOD酶活测定：邻苯三酚自氧化。

1.3.3多酚含量测定

 福林酚比色法。

1.3.4抗氧化能力测定

 还原能力：普鲁士兰法；清除羟自由基能力：邻二氮菲-Fe2+自氧化法（Fenton法）；对ABTS+．的清除效果：总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）；铁离子还原能力：总抗氧化能力检测试剂盒( FRAP法)。

2结果与分析

2.1  美拉德反应过程中PPO酶活变化

 将经过去蒂剥皮处理的大蒜，放在恒温恒湿箱中进行美拉德反应，定时取样检测其中的PPO酶活。由图1可见，随着美拉德反应进行，大蒜中PPO酶活逐渐降低，在75℃，85%湿度下处理40 min后PPO残余酶活低于10%。

2.2 POD酶活变化

 在75℃，85%湿度的恒温恒湿箱中，随着美拉德反应进行，大蒜中POD酶活变化情况如图2所示。由图可见，大蒜POD活性也是随着反应时间延长而逐渐降低，在前1h反应期间POD失活较快，1h之后POD酶活已不足原来的40%，此后酶失活速度趋缓，反应2h后残余酶活低于10%，尽管POD相比PPO而言稳定性较高，失活较慢，但在给定条件下经过7h湿热处理POD也基本失活。

2.3蒜氨酸酶酶活变化

 图3反映的是大蒜美拉德反应期间蒜氨酸酶酶活的变化，从图中可以看出，随着反应进行大蒜中蒜氨酸酶的活性也是呈现总体下降趋势，其湿热稳定性比大蒜中的PPO还差，美拉德反应30 min时蒜氨酸酶的活性已几乎为零。

2.4y-谷氨酰转肽酶酶活变化

 在75℃．85%湿度的恒温恒湿条件下，大蒜美拉德反应过程中y-谷氨酰转肽酶活性随时间的变化见图4。与前面3种酶的变化趋势相同，y-谷氨酰转肽酶的活性也随着反应进行而降低，当反应进行60 min后酶活降为初始酶活的10%。相对蒜氨酸酶，y-谷氨酰转肽酶的热稳定性更高。

2.5  SOD酶活变化

  由图5可知，大蒜美拉德反应过程中，SOD酶的热稳定性比PPO，POD，蒜氨酸酶，y-谷氨酰转肽酶都高。尽管随着反应进行，SOD酶活总的变化趋势是下降的，但反应6h时残余酶活仍为25%，反应18 h后酶活仍然残留10%。

2.6多酚含量变化

  在75℃，85%湿度条件下恒温恒湿处理12 d，大蒜中多酚含量随时间的变化趋势如图6所示。由图可见，在12 d的美拉德反应过程中，大蒜中多酚含量一直呈现上升趋势，第12天时大蒜中多酚含量为6.5 mg/g，可以预测随着美拉德反应时间的延长，大蒜中的大分子化合物将进一步分解生成更多的没食子酸等含有酚羟基的化合物，即大蒜中多酚含量仍会进一步增加，但黑蒜作为一种具有保健功能的食品，首先要考虑其感官品质，在实验室前期试验中发现当发酵时间大于10 d时感官品质已变差，故试验设定美拉德反应时间为12 d。

2.7美拉德反应过程中抗氧化能力变化

2.7.1  大蒜还原能力的变化

 将经过去蒂剥皮处理的大蒜，放在75 ℃，85%湿度的恒温恒湿箱中发酵，研究美拉德反应对大蒜抗氧化能力的影响。图7是在12 d反应过程中大蒜还原能力的变化，由图可见，大蒜的还原能力在前4d提高较为和缓，4～10 d期间增加较为迅速，此后上升速度再次趋缓，在发酵结束时大蒜的还原能力约为反应前的9倍。

2.7.2大蒜清除羟自由基能力的变化

 美拉德反应过程中大蒜对羟自由基清除能力的变化见图8。在发酵前4d大蒜对羟自由基清除能力逐渐增强但增幅较缓慢，发酵4d以后增幅较大，直至12 d发酵结束时大蒜对羟自由基清除能力一直呈现上升趋势，此时大蒜对羟自由基的清除率几乎增长了23倍。清除率是反映被测物质抗氧化能力强弱的重要指标之一，清除率越大，表明抗氧化能力越强。美拉德反应期间大蒜对羟自由基清除率的变化趋势与多酚含量的变化相同。

2.7.3大蒜对ABTS+．清除能力的变化

 由图9可知，美拉德反应过程中，大蒜在整个发酵过程中的TEAC值一直上升，考虑到其感官品质，发酵只进行到12 d。在采用总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）测定抗氧化能力的ABTS法中，TEAC值表示被测抗氧化剂清除ABTS+．能力与标准抗氧化剂Trolox（VE的水溶性类似物）清除ABTS+．能力的比值，其数值越大表明被测物质的抗氧化能力越强。图9中曲线变化趋势表明，美拉德反应过程中大蒜的抗氧化能力一直在上升。

2.7.4大蒜对Fe3+还原能力的变化

 图10是采用总抗氧化能力检测试剂盒( FRAP法)测定的大蒜美拉德反应期间抗氧化能力的变化趋势，FRAP值是反映被测物质抗氧化能力大小的指标，其值越大表明被测物质的抗氧化能力越大。由图7~图10可见，大蒜美拉德反应过程中，无论是用大蒜的还原能力，大蒜对羟自由基的清除能力，大蒜对ABTS+．的清除能力，还是用铁离子还原能力来表示，大蒜的抗氧化能力都是增强的。由于各种抗氧化能力检测方法遵循的机理和误差不同，因此采用各种方法检测的待测物质抗氧化能力各不相同。

3结论与讨论

 由上述试验可知，美拉德反应过程中PPO、POD、蒜氨酸酶、y-谷氨酰转肽酶和SOD五种酶的热稳定性尽管不同，但在反应进行一天内都相继失活，而12 d发酵过程中多酚含量和抗氧化能力一直上升。在恒温恒湿的美拉德反应过程中，多酚可以由大分子化合物降解而来，多酚含量的增加可以增强大蒜的抗氧化能力。PPO，POD可以氧化多酚从而降低其抗氧化功能，但2.1和2.2试验结果表明，美拉德反应40 min后PPO基本失活，7h后POD基本失活，即PPO和POD不会对大蒜发酵后期的多酚含量造成影响。蒜氨酸酶可使大蒜中的y-谷氨酰肽类化合物经一系列反应生成具有一定抗氧化作用的大蒜素，y-谷氨酰转肽酶则会以y-谷氨酰肽类化合物为底物生成具有抗氧化作用的有机硫化物，但是2.3和2.4的结果表明这两种酶同样在美拉德反应开始后不久即失去活性，也就是说大蒜在美拉德反应期间抗氧化能力的增加与多酚有关，但受PPO、POD、蒜氨酸酶、y-谷氨酰转肽酶和SOD五种酶的影响很小。当然有文献报道美拉德反应过程中抗氧化能力的增强还与含硒的化合物，美拉德反应产物等特色功能成分有关。