氧化葡糖杆菌1.637山梨糖还原酶基因s r功能初步研究

陆璐1，2，熊向华2，汪建华2，赵巧林2，毕波2，梁志锋1，张惟材2

1．广西医科大学，广西南宁530021;2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100071

[摘要]  目的：研究山梨糖还原酶基因s r( B932_3022)在氧化葡糖杆菌1.637生长代谢中的作用。方法：构建s r基因同源敲除质粒p GX -srup-Gm-（down, PCR扩增得到打靶片段，电击转化导入氧化葡糖杆菌1.637，通过庆大霉素抗性和PCR筛选s r基因重组敲除菌，分别以山梨醇和山梨糖为碳源考察野生菌与敲除菌生长和山梨糖代谢的差异。结果：抗性和PCR验证结果显示敲除了氧化葡糖杆菌1.637的s r基因；与野生菌相比，敲除菌生长出现滞后，以山梨醇为碳源时敲除菌山梨糖积累增多，而以山梨糖为碳源时山梨糖消耗减少。结论：氧化葡糖杆菌1.637的s r基因敲除影响菌株前期生长与山梨糖代谢。

[关键词]  氧化葡糖杆菌；山梨糖还原酶；基因敲除；山梨糖

[中图分类号]Q933[文章编号]  1009-0002（2016）02-0192-04

 我国首创的维生素C( vitamin C，V c)两步发酵工艺已成为世界上V c生产的主流方法。第一步是在醋酸菌（生黑醋杆菌或氧化葡糖杆菌）的作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖（醇糖转化），第二步是由酮古龙酸菌和芽孢杆菌组成的混菌体系将L-山梨糖转化为V c重要中间体2-酮基-L-古龙酸（糖酸转化）。氧化葡糖杆菌（Glucon,obacter oxydan,s）作为V c生产菌，在第一步发酵中负责将山梨醇高效转化为山梨糖。本实验室已完成一株氧化葡糖杆菌全基因组序列分析，并分别以山梨醇和山梨糖为碳源进行了转录组分析，通过基因组注释及转录组差异分析，结合文献调研，我们推测B932_3022基因编码的山梨糖还原酶（/-sorbose reductase，SR）可能负责在胞内将山梨糖还原成山梨醇。为了确证山梨糖还原酶基因s r的功能，我们以氧化葡糖杆菌1.637为研究对象，通过同源重组敲除了s r基因15-61，并分别以山梨醇和山梨糖为碳源研究了敲除菌生长和山梨糖代谢情况，考察了s r基因在氧化葡糖杆菌1.637生长代谢中的作用，为后续山梨糖代谢通路研究及醇酸一步发酵工程菌改良奠定了基础。

1  材料与方法

1.1材料

 氧化葡糖杆菌1.637，大肠杆菌λ-pir感受态细胞，质粒p GX、pBBRIMCS5为本实验室保存；大肠杆菌DH5a感受态细胞、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司；dNrrP、HiFi Taq DNA聚合酶等购白北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Ta KaRa公司；测序及PCR引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成（引物序列见表1）。

 LB培养基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0）；YBH培养基（山梨醇10 g/L，酵母粉7 g/L，碳酸钙0.1 g/L，pH6.8～7.0）；YBHT培养基(山梨糖10 g/L，酵母粉7 g/L，碳酸钙0.1 g/L，pH6.8～7.0)；红四氮唑溶液（1%红四氮唑，4%氢氧化钠，避光备用）。

 PCR仪（Bio-Rad公司）；台式离心机(Eppendorf公司)；凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（Pharmacia Biotech公司）；电击仪（Bio-Rad公司）；分光光度计（UNICO公司）。

1.2基因组提取及常规分子生物学操作

 PCR、酶切、连接、质粒转化等常规分子生物学操作按照文献方法进行。

1.3  敲除质粒的构建

 以氧化葡糖杆菌1.637基因组为模板，分别扩增1500 b p大小的s r基因上、下游片段，以pBBRIMCS5为模板扩增庆大霉素(Gm)基因片段，琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；将s r的上游同源臂与质粒pGX分别用Kpn, I.Xho I双酶切，然后连接、转入大肠杆菌λ- pir感受态细胞，获得pGX-srup中间重组质粒；将pGX-srup质粒与s r的下游同源臂分别用Xho I、NotI双酶切，然后连接、转人大肠杆菌λ-pir感受态细胞，获得敲除质粒pGX-s rup-down中间重组质粒；将pGX-srup-down质粒与Gm基因片段用Xo I单酶切，然后连接、转入大肠杆菌λ-pir感受态细胞，获得敲除质粒pGX-.srup-Gm-down。

1.4打靶片段的克隆

 以pGX-  srup- Gm- down为模板，用引物up1500F、down1500R扩增含有s r上、下游同源臂及Gm基因的片段，琼脂糖凝胶电泳分离回收后得到高浓度的线性打靶片段。

  1.5 s r敲除菌株的获得

 制备氧化葡糖杆菌1.637感受态，将含有s r基因上、下游同源臂及Gm基因的线性打靶片段加入氧化葡糖杆菌1.637感受态细胞中，混匀，转入0.2 cm电击杯中，用电击仪进行电击转化（电击条件：电压2.5 kV．时间5 ms，电阻200 n，电容25μF），电击后迅速加入200μL YBH培养基，300C、200 r/min摇床振荡培养4h，涂布于含20μ g/m L庆大霉素的 YBH平板，300C培养3d，挑取平板．E长出的单菌 落，通过组合PCR进行敲除菌的验证。

1.6  菌株生长评价

 挑取氧化葡糖杆菌野生菌1.637与s r基因敲除菌1.637Asr，300C培养24 h，分别按相同接种量接种至100 m L液体YBH和YBHT培养基中，300C同步培养，每隔8h取样测定D600nm值，根据以山梨醇和山梨糖为碳源的培养结果绘制2种菌的生长曲线。

1.7代谢产物薄层层析检测

 离心取上述1.637与1.637Asr菌48 h的培养上清液，点于硅胶G薄层板上，用正丙醇-水-1%磷酸-甲酸(400:100:10:1)展开，用红四氮唑溶液喷雾显色；以2%山梨糖标准品为对照。

2结果

2.1  s r基因上、下游同源臂及Gm基因的PCR扩增

 以up1500F、up1500R及down1500F、down1500R为引物，氧化葡糖杆菌1.637基因组DNA为模板，PCR扩增得到s r基因的上游片段(1500 b p)和下游片段(1500 b p)；以G m F、G m R为引物，从质粒pBBRIMCS5中扩增得到Gm基因片段(789 b p)，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR扩增片段大小与预期值一致（图1）。

2.2  sr基因敲除质粒的构建

 分别用K p n I/X ho I和X ho I/Not I双酶切p GX-.srup-Gm-down，都得到了与预期大小相符的s r基因上、下游同源臂及Gm基因片段（图2），测序结果比对分析也证实敲除质粒连入序列与预期序列完全一致，表明s r基因敲除质粒构建成功。

2.3打靶片段的制备 

以up1500F、down1500R为引物，s r基因敲除质粒为模板，PCR扩增了基因打靶片段(srup- Gm-down)，经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收，如图3所示，PCR扩增片段大小与预期(3801 b p )相符。

2.4  s r基因敲除菌的鉴定

 如果发生同源双交换，庆大霉素基因Gm将取代s r。以sr基因敲除菌氧化葡糖杆菌1.637△s r基因组DNA为模板，up1650F/G mR、G mF/down1650R、G mF/G mR为引物对进行PCR扩增，应分别扩增得到2445、2445、789 b p的片段，用引物s r F/sr R进行PCR扩增应得到阴性结果；相反，如果以野生型氧化葡糖杆菌1.637基因组为模板，up1650F/G m R、G mF/down1650R、G mF/G m R为引物对进行PCR扩增，应得到阴性结果，而以s r  F/s r R引物对PCR扩增应得到792 b p的片段。组合PCR鉴定结果（图4）与以上s r基因敲除菌预期完全一致，表明氧化葡糖杆菌1.637的s r基因敲除成功。

2.5  sr基因缺失对氧化葡糖杆菌1.637生长的影响

 在以山梨醇为碳源的培养基(YBH)中，与野生型氧化葡糖杆菌1.637相比，基因敲除菌1.637△s r生长出现了滞后。氧化葡糖杆菌1.637生长约16 h达到平台期，而1.637△s r需要约32 h（图5）。在以山梨糖为碳源的培养基(YBHT)中培养时，1.637△s r生长滞后期延长，氧化葡糖杆菌1.637约16 h达到平台期，而1.637△sr在40 h后才进入对数生长期，达到平台期需要约48 h（图6）。

2.6氧化葡糖杆菌1.637Asr山梨糖代谢分析

 利用薄层层析分析氧化葡糖杆菌1.637及1.637△s r代谢产物山梨糖的差异。以山梨醇为碳源时，1.637△s r山梨糖的积累明显高于1.637（图7）；而以山梨糖为碳源时，1.637△s r山梨糖的消耗明显低于1.637（图8）。

3讨论

 山梨糖是V c发酵的重要中间产物，我们实验室通过前期研究，推测在氧化葡糖杆菌中可能存在2条与山梨糖相关的代谢通路：一条是在山梨糖脱氢酶作用下转化为山梨酮山梨酮再经过山梨酮脱氢酶催化转化为V c的前体2-酮基-L-古龙酸；另一条代谢途径是山梨糖在山梨糖还原酶的作用下转化为山梨醇，山梨醇经过木糖醇脱氢酶转化为果糖。

 本研究中，我们对氧化葡糖杆菌1.637山梨糖还原酶SR (B932_0302)基因的功能进行了初步探索。通过对氧化葡糖杆菌1.637野生菌和s r基因敲除菌生长及山梨糖代谢的考察，我们发现敲除s r基因的菌株前期生长受到影响，其中在以山梨糖为碳源的培养基中影响最为明显，山梨糖的消耗也明显少于野生菌，这些结果提示基因s r可能在菌体前期生长和山梨糖积累利用方面发挥作用。此外，通过基因组注释我们还发现氧化葡糖杆菌1.637另外2种山梨糖还原酶SR( B932_1330)、SR( B932_1684)，并分别对其进行了敲除，结果显示这2种山梨糖还原酶基因的敲除菌在生长及山梨糖代谢方面与野生菌相比并无显著差异。因此我们认为山梨糖还原酶SR B932_0302)对氧化葡糖杆菌1.637菌体的生长及山梨糖代谢有重要的作用。