细胞型朊蛋白抑菌活性的初步探索

王立娟1，胡萍萍2

1．商丘医学高等专科学校基础医学部，河南商丘476100;2．重庆大学创新药物研究中心，重庆400044

[摘要]  目的：研究细胞型朊蛋白( P r Pc)有无抑菌活性。方法：把P r Pc分别与金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌等5种菌孵育一定时间，然后用碘化丙锭对上述5种样品染色后采用流式细胞仪检测各样品的荧光信号。结果：通过对流式细胞仪的荧光信号进行分析，发现P r P c对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性，而另外3种菌的样品没有检测到荧光信号的增强，亦即P r Pc对这3种菌无抑菌活性。结论：细胞型朊蛋白有一定的抑菌活性，有望成为一种新型的抗菌肽。

[关键词]  细胞型朊蛋白；抑菌活性；抗菌肽；荧光信号

[中图分类号]  Q93-33; R915[文章编号]  1009-0002(2016)02-0257-03

 抗生素的出现极大地降低了感染性疾病的死亡率，给人类做出了巨大贡献。但是抗生素的不合理使用使得微生物的耐药性变得相当严重，而且还出现了超级细菌。近年来在抗生素的开发方面并没有取得很大进展，所以在感染性疾病的治疗方面，人类重新面临很大的压力和挑战。针对这一问题，科学家正在进行辛勤不懈的探索，试图找出对策或新的治疗药物。

 Bomanl21于1975年从惜古比天蚕（Hyalophoracecropia）中诱导出具有抗菌活性的小分子肽，这种物质可以抑制细菌的生长，被称为抗菌肽。除了抑制细菌外，抗菌肽还可以抑制病毒、真菌、寄生虫，对肿瘤细胞也有作用，所以抗菌肽的发现给人类感染性疾病的治疗带来了新的希望。抗菌肽在自然界中广泛存在，很多生物都能产生，迄今，在微生物、昆虫、无脊椎动物、植物、鸟类、两栖类、鱼、哺乳动物（包括人类）等的体内已发现数百种抗菌肽。通常抗菌肽分子很小，含有12～100个氨基酸残基，一般带2～9个正电荷，是两性分子。由于抗菌肽具有广谱、高效的杀菌作用，且不易产生耐药和交叉抗性，有望成为可替代抗生素的一类新型药物。

 细胞型朊蛋白(cellular prion protein，P r Pc)是细胞内正常存在的非传染性糖蛋白，相对分子质量只有33x103~35x103，包括一个灵活的N端区域，以及由3个a螺旋、1个短的双链反平行B片层结构组成的球形C端区域。南于P r P c是小分子肽，也是两性分子，所以和抗菌肽的某些特征类似，可能具有抗菌肽类似的抗菌活性。阐明P r P c的生理功能，对人和

动物的传染性海绵样脑病的治疗也有重要意义。到目前为止，对于P r Pc的生理功能唷较多看法，比如细胞摄取或与铜离子结合、抗细胞凋亡和抗氧化作用、参与造血干细胞的更新、跨膜信号传导、形成和维持神经突触、与细胞外基质的黏附等；此外，还发现它与肿瘤关系密切，但并没有关于它有抑菌活性的报道。在本实验中，我们利用流式细胞术对Pr Pc的抑菌活性进行了初步研究，这对于进一步探索其生理功能、研究其与传染性海绵样脑病的关系，

以及开发抗菌肽都有很重要的意义。

1  材料和方法

1.1材料

 金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、大肠杆菌BL-21由西南大学生命科学学院提供；营养肉汤液体培养基、LB同体培养基（自制）；碘化丙锭(propidium iodide，PI)（Sigma公司）；3010 uv -vis分光光度计（日立公司）；EPICSXL流式细胞仪（贝克曼库尔特有限公司）。

1.2细胞型朊蛋白的分离纯化

 在LB培养基（含有卡那霉素）上接种大肠杆菌BL-21（携带可表达Pr Pc的基因），37C过夜培养，挑单菌落接种于2.5 m L含1%0卡那霉素的LB液体培养基中，置220 r/min摇床中37。C培养过夜，次日上午将该2.5 m L菌液接种在含l%。卡那霉素的250m L 2xYT液体培养基中，置220 r/min摇床中37℃培养，当菌液D600nm值为0.6～1.0时加l%0 IPTG诱导，

继续在摇床中培养6h左右，离心菌液，将沉淀重悬于60 m L裂解液中，超声波破碎至菌液澄清，再离心收集含有朊蛋白的沉淀，用50 m L裂解缓冲液加2mol/L Na Cl、5%  Triton  X- 100和裂解缓冲液加2mol/L尿素各洗涤一次，每次洗涤经磁力搅拌20 min后于12 000 r/min离心15 min；留样做SDS-PAGE检验；下层用变性缓冲液悬浮，4cC搅拌过夜使蛋白质充分变性，然后离心去除沉淀，上清液过Ni柱，上样完成后用复性缓冲按浓度递减的顺序使蛋白质复性，用洗脱缓冲液把朊蛋白从Ni柱上洗脱下来，经SDS-PAGE检测，并用Bradford蛋白质试剂盒定量。

1.3抑菌活性实验

 在LB平板E划线活化各菌，分别挑单菌落于营养肉汤培养基中，在220r/min、370C摇床中培养过夜，4000 r/min离心5 min收集菌体，将各菌浓度调为0.5 McFarland Standard，再将P r Pc与各菌于370C孵育30 min，各样品用15μL 1mg/m L碘化丙锭室温环境下避光染色15 min，上流式细胞仪检测。

2结果

2.1  细胞型朊蛋白与金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的作用情况

 图1是P r Pc分别与金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌作用情况的荧光图。横坐标表示样品的荧光强度，纵坐标表示细胞数目。P r Pc与金黄色葡萄球菌相互作用一定时间，PI占84.94%，而阴性对照的PI占29.76%。从数据和图均可明显看出被P r Pc作用过的样品的荧光强度比阴性对照要强，这问接说明金黄色葡萄球菌被P r Pc作用后受到了损害，使原本不能进入活细胞的染料PI进入了细菌体内，并与DNA结合，从而产生了荧光强度的增强，证明 P r Pc对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。图1B示P r Pc与枯草芽胞杆菌相互作用的结果，被P r Pc作用过的枯草芽胞杆菌样品的PI为49.94%，阴性对照的PI为14.40%。从数据和图均可明显看出被P r Pc作用过的样品的荧光强度比阴性对照强，同样说明P r Pc与枯草芽胞杆菌发生了作用，使枯草芽胞杆菌受到了损害，因此P r Pc对枯草芽胞杆菌也有抑制作用。

2.2细胞型朊蛋白与另外3种细菌的作用情况

 同样，随机试验了P r Pc对另外3种细菌，即巨大芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和大肠杆菌BL-21的作用情况，结果如图2所示。各菌与P r Pc作用后样品的荧光强度与阴性对照相比基本上没有变化，由此推测，P r Pc对巨大芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和大肠杆菌BL-21没有抑菌作用，所以样品被P r Pc作用后用PI染色没有检测到荧光信号的增强。

3讨论

 实验所用染料PI是一种不透膜染料，即当细菌细胞膜完整时PI不能进入细胞；只有当细菌细胞膜破损，该染料才可进入细菌细胞，并与核酸结合，从而造成荧光强度增强，荧光信号可用流式细胞仪检测。我们用流式细胞仪对细胞型朊蛋白的抑菌活性进行了初步探索。通过P r Pc与各细菌作用后荧光强度的变化，可以初步判断P r Pc是否对该细菌有抑制杀伤作用。我们随机试验了5种菌，发现P r Pc对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用，而对另外苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和大肠杆菌BL-21没有抑制作用。由此可见，P r Pc有一定的抑菌活性，可能是一种潜在的抗菌肽，但其抗菌选择性和抗菌机制尚须进一步研究确认。

 到目前为止，现有抗菌肽的作用机制还没有完全阐明，仍然存在争议。但是，不管抗菌肽的具体作用机制如何，它们的活性几乎大都依赖于与细菌细胞表面的相互作用，因抗菌肽大都带有2～9个正电荷，所以带正电荷的抗菌肽首先与细菌细胞表面的带负电荷的成分，如G菌细胞壁上脂多糖中的磷酸基团，或G+菌细胞壁上的磷壁酸以静电相结合。因此，P r Pc对不同细菌所具有的不同抑菌活性可能与细菌细胞表面所带基团有关，或与芽胞杆菌的不同抗逆性有关，这还有待深入探讨。