复发缓解型实验性变态反应性脑脊髓炎动物模型的建立

王静1a，2，张旺倩1b，褚楚1b，吴守振1b，王舒宁1b，刘楠楠1c冯国栋1a

1．第四军医大学a．西京医院神经内科，b．药学院生物制药学教研室，c．基础部教学实验中心，陕西西安710032；2．解放军第四五一医院神经内科，陕西西安710054

[摘要]  目的：建立复发缓解型实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)动物模型，进行病理学研究，为多发性硬化(MS)的发病机制研究及治疗药物研发提供合适的动物模型。方法：选择不同品系动物（昆明种.BALB/e和C57BL/6小鼠，SD大鼠），采用各自品系来源的脊髓和弗氏完全佐剂混合乳剂一次性注入动物双足垫，1周后半剂量注射进行一次加强，诱导EAE;观察发病情况，HE染色观察病理变化，监牢兰染色观察脱髓鞘情况。结果：昆明种.BALB/e和C57BL/6

小鼠均无明显症状，HE染色小脑的脊髓无炎性细胞浸润；SD大鼠对照组正常，模型组临床症状发生率为90%以上，HE染色可见小脑白质及脊髓血管周围有大量的炎性细胞浸润，监牢兰染色可见大片髓鞘脱落。结论：EAF模型在昆明种.BALB/c及C57BL/6小鼠中用脊髓匀浆不易于诱导．而用SD大鼠脊髓髓鞘蛋白和弗氏完全佐剂混合乳剂可高效率诱导出同种SD大鼠的复发缓解型EAE。

[关键词]  多发性硬化；实验性变态反应性脑脊髓炎；动物模型

[中图分类号]R744.5  [文章编号]  1009-0002(2016)02-0219-04

 多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质脱髓鞘病变为特点，遗传易感个体与环境因素作用发生的自身免疫性疾病。MS是中枢神经系统脱髓鞘疾病中最常见最主要的疾病，常发于青中年，难以痊愈，可进行性加重并可致残。MS的发病机制还不明确，目前的主流观点认为该病主要来自识别CNS抗原的自身反应性T淋巴细胞介导的免疫反应所引发的CNS蛋白质损伤，甚至于导致神经元损害。越来越多的诸如TH17、NKT等T淋巴细胞亚群被发现在MS患者脑组织高水平浸润，但近来的临床数据及动物实验也提示B淋巴细胞可能也在MS发生发展中扮演着重要角色。多发性硬化根据发病的特点可以分为温和型、复发缓解型、复发渐进型和慢性渐进型等多种类型，其中25 010以上的病人为复发缓解型(re-lapse remitting MS，RRMS)。目前对于MS的治疗多着眼于修复既有的神经损伤，疗效不好且伴有明显的毒副作用。基于上述基础研究和临床应用中的结果，深入探讨MS的发病分子机理并研发特异高效性的治疗药物尤为重要。实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)也称为实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental auto-immune encephalomyelitis，EAE)，是研究MS经典且公认的动物模型，与MS在发病机理及病理过程上具有相似性c5-61。为了建立理想的EAE模型，我们选取了昆明种、BALB/c和C57BL/6小鼠及SD大鼠，分别以各自品系的脊髓匀浆(spinal cord homogenate，

SCH)与弗氏完全佐剂(complete Freund adjuvant，CFA)乳化后作为抗原，分2次间隔1周后足掌和尾部皮下注射，观察动物EAE症状，并于首次注射30d后取小脑和脊髓固定后切片染色，考察各品系的出模情况。

1  材料与方法

1.1材料

 1月龄SPF级昆明种、BALB/c、C57BL/6小鼠和SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供，其中小鼠体重18+1 g，大鼠体重200+20 g，每种品系的动物各30只，随机分为正常喂养组、阴性对照组(CFA组)和模型组( SCH+CFA)，每组各10只；弗氏完全佐剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2动物模型诱导

 方法并加以改良。麻醉各品系小鼠及SD大鼠，用冰浴的生理盐水灌注后于75%酒精中

浸泡消毒灭菌；无菌条件下剥离全脊髓，去除硬脊膜和血管后称重；加入适量生理盐水(重量体积比为50%)并在玻璃匀浆器中制备成匀浆，然后与等体积的CFA混合后用注射器反复抽打制成油包水样，为抗原乳剂；在小鼠和大鼠2只后足掌皮下分别注入制备好的抗原乳化剂0.2 m L，1周后再次注射0.1 m L加强免疫一次；阴性对照组用等体积的CFA进行免疫。

1.3临床评分

 将第一次注射日期规定为第0d。每日观察动物2次，按照Weiner等修正标准进行EAE临床评分。0分：表现正常无明显症状；1分：尾部远端肌肉张力丧失；2分：轻微的后肢麻痹；3分：双后肢严重麻痹；4分：后肢瘫痪；5分：濒死状态。

1.4取材、切片及病理形态观察

 所有动物在首次免疫后第25 d取材。注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后用生理盐水及4%多聚甲醛( pH7.4)灌注和固定，取出小脑和脊髓，置于10%的甲醛溶液中固定2～3 d待检；固定好的组织冠状切取大脑视交叉处、小脑皮层、脑干、颈膨大、胸髓和腰膨大等部位组织，石蜡包埋，制成厚度5μm的全脑和脊髓切片，进行HE和监牢蓝染色，显微镜下观察病理形态。

1.5  统计学方法

临床评分以mean +S EM表示，计量资料采用方差分析和q检验，发病率的组间比较采用X2检验。

2结果

2.1 EAE的临床表现

 正常对照和阴性对照组均未出现症状，体重持续增加，活动度正常。所有小鼠的模型组也正常；大鼠模型组表现为少食消瘦、萎靡、拖尾、步态异常或肢体瘫痪，症状出现时间约为第11 d，所有大鼠均有不同程度的症状，先是尾部远端失张力，随后伴有后肢瘫痪，症状随时间推移加重，但未见死亡。各组发病率及临床评分见图1。

2.2病理改变

 3种品系的不同组小鼠、大鼠正常喂养组及阴性对照组神经组织病理检查未见异常，HE染色小脑白质及脊髓无炎性细胞浸润，监牢蓝染色未见髓鞘脱失（图2、3、4）。SD大鼠模型组小脑、脊髓白质内有大量的炎性细胞浸润，形成典型的“袖套”样改变，有的在脑干部位也有不同程度的浸润（图5），监牢蓝染色发现在细胞浸润的部位有严重的髓鞘脱失（图6）。

3讨论

 动物模型在EAE与人类中枢性脱髓鞘疾病MS极其相似，已成为研究MS发病机制、病理及临床的  理想动物模型。诱发EAE敏感动物品系有Lewis、DA大鼠，PL/J、SJL/J小鼠及Hartley、Strain13豚鼠等，但因价格昂贵、不易获得或难以饲养等因素限制了其在国内的使用。国内多采用Wistar大鼠作为EAE模型动物，在制作模型过程中需要使用百日咳疫苗

作为免疫增强剂或使用纯化的髓鞘碱性蛋白( my-elin basic protein，MBP)、人工合成的髓鞘少突胶质糖蛋白(myelin oligodendroglia glycoprotein,MOG)等，操作复杂，而且有报道在Wistar大鼠诱导EAE时有时会引发耐受。 

本研究中，我们拟探讨国内常用品系小鼠和大鼠中的EAE出模情况，选择了昆明种、BALB/c和C57BL/6小鼠及SD大鼠进行EAE模型的诱导。昆明种小鼠是汤飞凡教授引自美国洛克菲勒研究所培育的Swiss小鼠，是我国生产量、使用量最大的远交系小鼠，占我国生物医学动物实验小鼠总用量的70%：C57BL/6是全世界最常用的近交系小鼠，可用于免疫学和神经生物学等研究；BALB/c小鼠常用于免疫学和炎症的研究；SD大鼠为封闭群大鼠，由于其适应性和抗病能力更强而广泛用于生物医学研究。

 我们利用现有条件，采用SCH+CFA即可在SD大鼠中诱导出EAE模型。较之国外多采用异种来源的脊髓，本研究采用同种源的脊髓作为诱导抗原，如果诱导出有效的自身抗体，则有利于EAE的维持及进一步复发，应该适宜于缓解复发型EAE模型的构建。同时，我们使用CFA作为免疫增强剂，使得诱导条件更加简便。

 研究结果表明，SD大鼠最早可在第11 d发病，第17 d左右达到高峰，随后缓解并再次复发，出现典型的缓解复发型EAE症状，发病率达90%以上。HE和监牢兰染色结果显示，SD大鼠的小脑和脑干白质内小血管周围有大量淋巴细胞和巨噬细胞等浸润，形成明显的“袖套”样病变；脊髓和小脑中可见明显的髓鞘结构疏松和髓鞘脱失。当使用该方法在小鼠中诱导模型时，在BALB/c、C57BL/6及昆明种小鼠中均没有诱导出EAE模型，小鼠表现正常，组织染色也未见明显的病理改变，与此前报道相符。本研究结果表明，采用SD大鼠脊髓和弗氏完全佐剂混合乳剂能诱导SD大鼠发生复发缓解型EAE，方法可靠，出模率和重复性好，可以作为MS发病机制研究及相关重组疫苗和治疗性药物研制的理想模型。