Snail真核表达载体的构建及功能鉴定

陈滢洁1，姜潇1，李欣1，张亚楠2，刘婕2，罗晓丽2，贾晓蒙2，丁丽华2，叶棋浓2，宋玉华1

1．青岛大学附属医院乳腺中心，山东青岛266003;2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850

[摘要]  目的：构建Snail的慢病毒真核表达载体，并研究Snail在肿瘤发生和发展过程中对上皮-间质转化(EMT)的影响。方法：以乳腺文库为模板，PCR扩增Snail的全长编码序列，将其克隆到p CDH表达载体上，构建成p CDH-Snail真核表达载体，转染293T细胞,Western印迹检测p CDH载体介导的Snail的表达；与包装质粒共转染293T细胞，包装病毒后感染ZR75-1细胞，经嘌呤霉素筛选2周，得到稳定表达Snail的ZR75-1细胞株，检测ZR75-1细胞对EMT的影响，同时用倒置荧光显微镜观察ZR75-1稳定细胞株中上皮钙粘蛋白分布的变化。结果：BamH I .Xba I双酶切及测序证实得到pC DH-Snail表达载体，Western印迹表明Snail在293T细胞内得到成功；经嘌呤霉素筛选，获得稳定表达Snail的ZR75-1细胞株；在倒置荧光显微镜下观察，ZR75-1稳定细胞株中的上皮钙粘蛋白绿色荧光明显减弱。结论：构建了p CDH-Snail的慢病毒真核表达载体，建立了稳定表达Snail的ZR75-1细胞，为进一步研究Snail在EMT过程中的机制奠定了基础。

[关键词]Snail,上皮钙粘蛋白；上皮-间质转化；真核表达载体

[中图分类号]  Q78; Q24[文章编号]  1009-0002(2016)02-0200-04

 肿瘤的发生和发展是在多种致癌因子的作用下，发生基因突变，致使细胞增生失控所致，其中上皮-间质转化( epithelial- mesenchymaltransition，EMT)在肿瘤的发生发展和浸润转移方面起到了至关重要的作用。EMT发生于多种病理和生理过程中，主要特点是上皮细胞极性丧失、间质特性的获得、细胞形态改变和细胞迁移等。EMT与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系。在此过程中转录因子Snail可以激活EMT，因而近年Snail在EMT与肿瘤转移中的作用越来越受到人们的关注。Snail最先在果蝇中被发现，随后有报道Snail在其他非脊椎与脊椎动物的胚胎中胚叶存在表达。Snail作为一种起负调节作用的锌指转录因子，在不同的动物群体中其序列和功能都不尽相同。最近的研究表明，在人的Snail序列中存在2个糖原合酶激酶( GSK)-3b保守位点，GSK-3b的磷酸化可调节Snail的稳定性和亚细胞定位。Snail作为转录因子与许多靶基因相互作用，其中上皮钙黏蛋白( E- cad-herin)被认为是Snail直接作用的靶基因。至今，已发现一系列Snail可直接或间接调节的靶基因，如Snail可以下调桥粒蛋白、上皮黏蛋白1和细胞角蛋白18等上皮标志分子，并导致波形蛋白和纤连蛋白上调或重新分配。在多数肿瘤组织以及从口腔扁平细胞肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌和黑素瘤等癌症分离出的细胞系中，均可以检测到Snail和上皮钙黏蛋白的负相关表达关系。Snail抑制上皮钙黏蛋白的表达从而导致上皮间连接的破坏，使癌细胞问黏附松散，易于脱离原发灶而发生侵袭转移。许多研究显示转录因子Snail通过与上皮钙黏蛋白启动子区的E-box结合，下调上皮钙黏蛋白的表达，进而诱导EMT的发生。肿瘤细胞可以通过多种途径使癌细胞发生侵袭转移，其中上皮钙黏蛋白的黏附作用降低是其中的一方面，所以上皮钙黏蛋白黏附作用增强被看作肿瘤转移的抑制因素之一。为进一步研究Snail的过量表达在肿瘤发生和发展过程中对EMT的影响，我们从乳腺cDNA文库中获得了Snail的全长编码序列，构建了Snail过表达的慢病毒真核表达载体，转染293T细胞后检测其表达。我们的研究为进一步检测Snail过量表达在肿瘤发生和发展过程中对EMT的影响，以及在肿

瘤发生和发展中的作用奠定了基础。

1  材料和方法

1.1材料

 人乳腺癌细胞系ZR75-I、人胚肾293T细胞、大肠杆菌DH5a和慢病毒p CDH载体均为本实验室保存；DMEM培养基和胎牛血清购自杭州四季青生物公司；VigoFec由威格拉斯生物技术有限公司生产；限制性内切酶Bam H I、X ba I，LA  Taq酶和T4DNA连接酶购自Ta KaRa公司；质粒提取、胶回收和PCR回收试剂盒均为Promega公司产品；PCR引物及测序由天一辉远公司完成；鼠抗IgG抗体购自Chemi-con公司；GAPDH抗体购自SantaCruz公司。

1.2 pCDH-Snail慢病毒表达载体的构建与鉴定

和LA Ta q酶进行PCR扩增（反应条件：95℃变性1min，以95℃变性30 s、58℃复性30 s、72℃延伸50 s进行29个循环，循环结束后72℃再延伸7 min），扩增的Snail基因片段为795 b p。B a m H 1、X baI双酶切得到的Snail基因与慢病毒p C DH表达载体，回收酶切产物，用T4DNA连接酶于16℃连接8h，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，次日挑取平

板上的克隆至500μ LB培养基中，37℃培养2h，菌液PCR鉴定，阳性克隆经Bam H I、X ba I双酶切鉴定，鉴定为阳性的重组质粒再进行质粒序列测定，并与NCBI公布的Snail序列进行比对。

1.3  细胞转染和Western印迹检测

 将构建的p CDH-Snail真核表达载体和空载体p CDH分别转染293T细胞，24 h后收集细胞，用1×PBS洗2次，3000 r/min离心5 min，弃，上清，在细胞沉淀中加入2～3倍量的蛋白缓冲液( RIPA)，冰上裂解30 min，加入2xSDS上样缓冲液充分混匀，煮沸15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE（85 V电泳15 min，130 V电压50 min），电泳结束后用半干法电转50 min，将蛋白胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，再将硝酸纤维素膜用

TBST配制的5%脱脂奶粉封闭1 h或4℃封闭过夜，随后用5%脱脂奶粉稀释-抗(GAPDH 1：3000、

Snail 1:200)，4℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，每次5～7 min，后加入用5%脱脂牛奶1：5000稀释的鼠抗IgG抗体，室温轻摇2h，TBST洗膜3次，每次5min，将显影剂A、B液按1：1混匀并附膜反应15 min后显影。

1.4稳定克隆的筛选

 将293T细胞接种于6孔板，待细胞生长至密度为60%～70%，将3种包装质粒（0.84μg pLP1、0.4μgpLP2，0.56μg VSVG）分别与1μg构建的重组质粒p CDH-Snail和空质粒p CDH混匀后于200μL无血清无双抗的DMEM中，分别加入10 μL Mega-tran转染试剂，涡旋振荡10 s混匀，室温静置10min，将上述混合物加入接种好的293T细胞培养基中，6h换液，48 h收集上清。将上述包好的病毒按每孔约500 μL加入已接种于6孔板的细胞密度约为60%的ZR75-1细胞中，24 h换液，感染48 h后，每孔加入2μg/m L嘌呤霉素进行筛选，按时观察，待细胞死亡较多时更换培养基继续培养，并增加嘌呤霉素含量继续筛选，待细胞数量不再减少时即得到稳定的混合克隆，用Western印迹鉴定混合克隆。

1.5  Western印迹检测p CDH-Snail对EMT的影响

 将上述筛选的慢病毒真核表达载体ZR75-I细胞接种于6 cmμ L中，待融合至90%左右时收集细胞，用1xPBS洗2次，离心弃上清，加入2xSDS加样缓冲液，煮沸15 min，离心后取10μL上清蛋白进行SDS-PAGE，结束后转移至硝酸纤维素膜上，转膜后用5%脱脂奶粉于4℃封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉稀释的Snail(1：200)抗体、上皮钙黏蛋白(1:200) 抗体和GAPDH (1: 1000)抗体，4℃过夜，次日用TBST洗膜3次，每次5 min，加入用5%脱脂奶粉以1：3000稀释的鼠抗IgG抗体，室温轻摇2h，TBST洗膜3次，每次5 min，化学发光法显色5 min，压片显影。

1.6免疫荧光检测p CDH-Snail对EMT的影响

 将上述表达成功的ZR75-1慢病毒真核表达载体接种于24孔板，接种前于24孔板内放人事先消毒过的盖玻片，待细胞贴壁密度至30%～40%时，弃去细胞培养液，用1xPBS洗2次，加入甲醇，-200C固定5 min,用1xPBS于摇床上洗3次，每次10 min，用0.5% Tritonl00(溶于1%的羊血清)于冰上裂解细胞10 min，用1%的羊血清封闭30 min，然后将玻片细胞面向下倒扣在1%羊血清稀释的上皮钙黏蛋白(1：200)抗体中，于湿盒中4℃封闭过夜，次日将盖玻片按次序放入24孔板中，用1%的羊血清于摇床上洗3次，每次10 min，后加入1%羊血清稀释的FITC(1：1000)抗体，室温中放置2h（由于二抗中含有荧光素，此过程须避光），用1xPBS于摇床上洗3次，每次10 min，将1%羊血清稀释的DAPI(1：1000)核染色剂滴于载玻片上，盖玻片放于染色剂上5 min，用1×PBS洗2次，每次5 min，吸干PBS，载玻片上加15μL防淬灭剂，将玻片细胞面向下倒扣，用指甲油封片，在倒置荧光显微镜下观察，拍片记录结果。

2结果

2.1  p CDH-Snail真核表达载体的构建及鉴定

 以乳腺文库为模板，PCR扩增处Snail全长编码序列，长度应为795 b p，DNA凝胶电泳结果与预期大小相符（图1）。将PCR扩增的Snail编码序列及空载体p CDH均用Bam H I和X bⅡI双酶切，经连接、转化、抗性筛选得到重组质粒，并经PCR鉴定为阳性（未显示）。将PCR鉴定为阳性的重组质粒再用Bam H I和X b aI双酶切，在约795 b p处可见特异片段，而空载体对照无此片段（图2）。DNA序列分析证实该插入片段为Snail编码序列（序列未示）。

2.2 p CDH-Snail载体在293T细胞内的表达鉴定

 将上述阳性克隆提取质粒后转染293T细胞，对照组转染p CDH空载体，24 h后裂解细胞，Western印迹检测细胞内Snail的表达，以GAPDH为内参。结果见图3，转染p CDH-Snail载体的细胞中表达相对分子质量约33xi03的特异性条带，对照组明显减弱，与预期结果相符，表明p CDH-Snail载体携带的Snail编码序列能够在293T细胞中获得表达。

2.3  ZR75-1稳定克隆的建立及其对EMT的影响

 将上述经嘌呤霉素筛选的ZR75-1稳定克隆细胞株传代于6 cm皿，待细胞密度为80%～90%时收集细胞，Western印迹检测细胞p CDH-Snail对上皮钙黏蛋白的影响，以GAPDH为内参。结果见图4，上皮钙黏蛋白抗体在细胞中表达相对分子质量约120x103的相对于对照组减弱的条带，与预期结果相符，表明p CDH-Snail载体可以使细胞中上皮钙黏蛋白的表达减弱。

2.4免疫荧光检测p CDH-Snail对EMT的影响

 将上述筛选所得ZR75-1稳定克隆细胞株接种于24孔板，待细胞贴壁后，经1xPBS、甲醇处理，加入用1%羊血清稀释的上皮钙黏蛋白(1: 200)抗体，于湿盒中4℃封闭过夜，次日加入用1%羊血清稀释的FITC(1:1000)，室温放置2h，在荧光显微镜下观察，实验组细胞绿色荧光消失，而对照组胞质的绿色荧光蛋白分布均匀，无明显变化。

3讨论

 肿瘤的发生和发展是多种致病因素共同参与的过程，正常细胞发生病变后便失去了正常细胞的特性，致使组织结构紊乱，细胞连接疏松，癌细胞容易脱落游离，随血液或淋巴液等播散到全身，形成早期的远处转移，给癌症的临床治疗带来了很大困难。转录因子Snail在肿瘤发生、胚胎着床发育、细胞周期调控和创伤愈合等病理过程中发挥着巨大的作用。Batllesl等将反义Snail转染人结肠癌细胞HT-29，观察到细胞伪足缩短、细胞变圆，呈现间质细胞

样表型向上皮样表型转变的特征，表明Snail在肿瘤转移中起一定的作用。Cano等f91报道鼠皮肤癌的侵袭前脚细胞高表达Snail。此外，对人类肿瘤临床标本的免疫组化检测表明，Snail高表达于乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、结肠癌中，并与乳腺癌的组织学分级、淋巴结转移密切相关。EMT在肿瘤的发生发展、癌症扩散和伤口愈合等过程中发挥着重要的作用，EMT可由Snail从不同的途径得到启动。Snail在EMT的发生和发展过程中发挥核心作用，协调不同的信号通路，其中上皮钙黏蛋白的下调似乎是关键事件。Snail可与靶基因上含有CAGGTG核心碱基序列的E-box作用元件结合．从而调节其表达。当结合到E-box后，Snail家族成员充当转录抑制因子而发挥作用。Snail通过直接抑制上皮钙黏蛋白的表达，将上皮细胞转换为间充质细胞。上皮钙黏蛋白作为细胞黏附分子家族中的一种钙粘蛋白，与肿瘤的转移和浸润密切相关。上皮钙黏蛋白广泛分布于胚胎组织和成熟组织的上皮细胞中，除具有调节胚胎组织的发育、组织形成、参与细胞与细胞问信息传递交流等作用外，对促进细胞的黏附聚集、维持上皮形态结构的完整性、维持细胞极性和参与分化调节也至关重要。综上，我们构建了Snail过表达的克隆质粒p CDH-Snail，并验证了其在真核细胞中的表达，同时发现Snail过表达可以通过调节EMT而使上皮钙黏蛋白因子的表达减弱甚至消失。这为进一步研究Snail过表达在肿瘤发生、发展中的作用机制开辟了一条新路，同时为肿瘤的临床分子靶向治疗奠定了基础。