间接竞争ELISA检测核桃制品中核桃蛋白含量

 赖心田，冯荣虎，张世伟，王士峰，杨国武* 

 深圳市计量质量检测研究院（深圳518102）

摘要通过核桃蛋白组分分析，确定核桃丰度蛋白。以其作为抗原免疫小鼠，制备可特异性识别核桃蛋白的单克隆抗体，建立间接竞争ELISA检测方法。筛选出一株能稳定分泌抗核桃蛋白的杂交瘤细胞株HT-1,对间接竞争ELISA方法的反应条件进行优化后，建立了检测核桃蛋白的间接竞争ELISA方法，核桃蛋白的检测线性范围在4.6～64.2 μg/m L，IC50，为17.2 μg/m L，最低检测限为(0.67 μg/m L。抗体特异性较好，与其他的植物蛋白没有交叉反应。该方法适用于检测核桃制品中的核桃蛋白含量。

关键词  核桃：核桃蛋白：间接竞争法ELISA

 核桃营养丰富，是世界四大干果之一，是一种深受广大群众喜欢的食品。中国是核桃主要产区之一，面积产量居世界首位。数据显示，每百克核桃含有26.1 g核桃蛋白。其中主要由4种蛋白质构成，为清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白，分别占核桃蛋白总量6.81%，17.57%，5.33%和70.1 1%。核桃蛋白中含有18种氢基酸，种类齐全，且人体所需的8种必需氨基酸含量合理。对人体生理作用有着重要功能的谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量较高。

 目前，以核桃为原料的各种加工食品越来越多的出现在了市场上。核桃蛋白饮料中核桃蛋白的含量造假的报道越来越引起关注。国家标准GB 16322-2003“植物蛋白饮料卫生标准”只能依据凯氏定氮法对其总蛋白进行定量。三聚氰胺事件给依赖这一传统的技术手段进行蛋白检测的方法敲响了警钟。虽然，现在对三聚氰胺的控制卓有成效，但是对非法添加物的监控仍然是针对已知的、具体的物质进行检测。合成化学的飞速发展导致可以冒充蛋白质的物质众多，制假者的手段也在不断翻新，假如利用其它物质冒充蛋白，现有技术很难发现。另外，一些厂商还有可能使用廉价的蛋白替代核桃蛋白，如在核桃乳中掺人大豆粉或花生乳。具体掺人多少也因缺乏检测方法，全凭企业声称。

 为探索一种能够快速有效检测核桃制品中核桃蛋白的方法，试验采用单克隆抗体技术和酶联免疫吸附测定等技术，制备抗原，筛选核桃蛋白单克隆抗体，旨在建立检测食品中核桃蛋白含量的ELISA测定法。

1  材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试剂

 新疆核桃：市售；免疫佐剂Qpickantibody:北京康碧泉公司；5周龄BALB/c小鼠：广东省医学实验动物中心；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞：实验室保存；RPMI-1640培养基、胎牛血清和双抗( Penicillin-StreptomycinSolution)：GIBCO公司。

 TMB、牛血清白蛋白(BSA)：sigma公司；HRP标记山羊抗小鼠二抗：Proteintech公司；PAGE胶蛋白微量回收试剂盒：上海生工。其它试验试剂均为国产分析纯，实验室用水均为去离子水。ELISA其他溶液配方。

1.1.2仪器与设备 

蛋白电泳仪：Bio-rad；酶标仪：Biotek，美国；96孔酶标板和细胞培养瓶：Comning，美国；洗板机：Biotek，美国；电热恒温振荡水槽：上海一恒；手持式酸度计：Beckman Coulter，美国。其他常规试验仪器。

1.2试验方法

1.2.1抗原及抗体制备

 核桃仁中脂肪含量很高，因此要先将其除去。破碎核桃，称取5g核桃仁，将其磨碎。加入20 m L石油醚，在室温下脱脂0.5 h，之后离心去液体，重复脱脂3次，置于通风厨风干。称取1 g风干的核桃末，加入10 m L 8 mol/L尿素，用匀浆器打成乳状，得到核桃提取液。

 将核桃提取液进行SDS-PAGE电泳分析，选用12%分离胶，5%浓缩胶。用5x的上样处理液与核桃提取液混合；恒压80 V，30 min，120 V，1 h；染色0.5h，脱色过夜。

 依据凝胶过滤的洗脱体积，标准曲线和斯托克斯半径，研究者估算出核桃谷蛋白的相对分子量为48.68±26.95（平均值土标准偏差，n=4）。因此，切胶回收40 k D左右的条带，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收。回收好的蛋白放人冻干机中冻干。冻干的粉末再用8 mol/L尿素溶解，用PBS稀释后质量浓度为200 μg/m L．和等体积的免疫佐剂QUickantibody等

体积混匀，大腿肌肉注射免疫100 Vg/只，第21天等剂量加强免疫，第35天后尾部采血检测，测量血清多抗效价。单克隆抗体及腹水制备方法。

1.2.2  ELISA方法

 用棋盘滴定法确定ELISA的抗原包被浓度、一抗、样品和酶标二抗的稀释倍数。其他ELISA条件：96微孔板每孔用100 μL，质量浓度为10μg/m L核桃蛋白包被，4℃孵育过夜，次日弃上清液，用200μL含有2%BSA的PBST溶液37℃封闭2h，弃上清液，用PBST洗涤5遍拍干后，微孔板可密封4℃保存或者立即使用。

 间接竞争ELISA:取封闭好的微孔板室温平衡30min，先加入50 VL标准液或检测样本稀释液，再加入50μL单抗稀释液，37℃反应30 min，弃上清液，洗涤拍干后，加入HRP标记山羊抗小鼠二抗100 μL，37℃反应30 min，弃上清液，洗涤拍干后，加入TMB显色液，避光37℃反应10 min后，加入50 VL终止液终止反应，酶标仪450 nm检测吸光度。

1.2.3  ELISA方法的建立

 日常实际的核桃制品都是以水作为溶剂，因此标准品以水作为提取溶剂。将核桃破碎，称取5g核桃仁，将其磨碎。加入20 m L石油醚，在室温下脱脂0.5h，之后离心去液体，重复脱脂3次，置于通风厨风干。称取1g风干的核桃末，加入7 m L水进行溶解，之后用匀浆器混匀，离心后的上清溶液即为核桃水溶性蛋白。用凯氏定氮测量可溶性蛋白含量，先用PBST倍比稀释，按照优化的ELISA条件进行竞争试验，每个浓度重复4次，建立logit-log回归标准曲线。

1.2.4热稳定性与乳化剂影响

 核桃蛋白主要以球蛋白为主，在水中的溶解性差，对热极为敏感，核桃乳在加工和存储过程中易出现沉淀和脂肪上浮现象，在工业生产中会加入乳化剂来提高稳定性。因此，试验模仿核桃乳的加工工艺，观察这些条件是否对核桃蛋白的定量产生影响。在15μg/m L核桃蛋白液中加入0.1%的乳化剂，分别用巴氏杀菌法( 70℃，30 min)、100℃高温处理和超高温

瞬时灭菌( 121℃，5s)进行处理，用ELISA方法进行测定。

1.2.5  回收率与精密度

 在牛奶、花生乳及水溶液中加入100 Vg/g、10μg/g的核桃标准蛋白，计算添加回收率：回收率=测量值／添加值×100%。同理计算批内和批间的变异系数：CV=标准差(STD)／均值(X)×100%。

1.2.6交叉反应及实际样品测定

 用间接竞争ELISA测定其他蛋白样品作交叉反应试验，用PBS作为阴性对照。收集市场上的核桃制品，用间接竞争ELISA检测核桃蛋白的含量。

2结果与分析

2.1抗原蛋白的制备

 将核桃蛋白提取后，用12%的胶进行SDS-PAGE电泳，结果见图1，通过电泳图分析，核桃的丰度蛋白主要在20～40 k Da左右，最终选取高丰度的40 kD a蛋白作为抗原，通过胶回收试剂盒进行回收纯化。定量蛋白质量浓度到1 mg/m L，作为抗原免疫小鼠。

2.2  ELISA条件优化

 通过单克隆抗体的制备，筛选出特异性及亲和力都较好的细胞株，命名为HT-1。采用棋盘法确定抗原包被浓度及-抗的稀释倍数，结果见图2。最终确定核桃包被浓度为4μg/m L，单抗的稀释倍数为1：20 000。

 由图3可知，以横坐标x=1g（蛋白浓度），y=l n(B／B0)，得到抑制回归曲线y=3.034 10-2.497 31x，相关系数R2=0.998 5，线性检测范围为4.6～64.2μg/m L，半数抑制浓度IC50=17.2 μg/m L，最低检测限0.67 μg/m L。其中，B为PBST空白对照OD450，B为不同试验组OD450。

2.3  回收率与精密度检测

 在牛奶和椰子乳中分别加入核桃蛋白，计算ELISA方法的回收率，结果见表1。从表1可知，在牛奶中样品的平均回收率为109%，在椰子乳中的平均回收率为101.7%，平均相对标准偏差值为5 .1%，最大值不超过10%，说明该方法准确度高，稳定性好。

2.4热稳定性与交叉反应

 用3种不同的加热方式及乳化剂对核桃蛋白进行处理，结果见表2。从表2可知，巴斯消毒、100℃高温处理和超高温瞬时灭菌在是否加入乳化剂的条件下所测的核桃浓度与实际的添加浓度差别很小，表明100℃高温处理及乳化剂不会影响核桃抗原表位的识别，因此该方法可以用于检测高温及乳化处理的核桃制品。

 ELISA方法的特异性试验用交叉率表示，交叉率越高交叉范围越大，说明ELISA检测的特异性越差。由表3可知，采用间接竞争ELISA方法评估抗体对几种食品中常见蛋白和干扰物的交叉反应。除了跟核桃有反应外，其他植物蛋白反应率低于1%，说明此方法特异性良好，对食品几种常见的蛋白无交叉反应，不易出现结果误判。

2.5  ELISA方法测定实际样品中核桃蛋白浓度

 从深圳市场上购买到3种核桃乳和4种核桃粉，由表4可知，其中2种核桃乳核桃蛋白浓度较高，样品3是复合核桃乳，核桃只是其中一种成分，测得的核桃乳核桃蛋白含量很低，4种核桃粉的核桃蛋白浓度相对较低。由于核桃蛋白以球蛋白为主，在水中溶解性差，而日常的核桃制品都是水溶性为主，因此，核桃粉类制品在实际检测中核桃蛋白含量会相对较低。核桃乳经过加工处理后核桃蛋白含量相对较高。

3结论

 试验以核桃制品掺假问题作为出发点，通过单克隆抗体技术筛选出一株能特异性识别核桃可溶性蛋白的细胞株HT-1，建立间接竞争ELISA方法对核桃蛋白进行定量。此方法检测实际样品稳定可靠，不易受乳化剂及高温的干扰，具有较好的实际应用价值和开发成商品化试剂盒的潜力。目前，市场上核桃蛋白定量的试剂盒仍是空白，试验能够为核桃制品的监督提供一种高效稳定的检测方法，为广大消费者提供保障。