唐雅茹1，国立东1,2，王娜娜1，霍责成1*
1．东北农业大学乳品科学教育部重点实验室(哈尔滨150030)；2．黑龙江中医药大学药学院(哈尔滨150030)
摘要对初步筛选得到的胆酸盐水解酶活性高的2株乳杆菌进行了16S rDNA鉴定，结果表明，KLDS l.0317和KLDS l.0386均为植物乳杆菌。以牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐为底物，对两株植物乳杆菌所产BSH的比酶活进行了测定，试验证明了BSH具有底物特异性，且两株菌降解甘氨结合胆盐的能力强于牛磺结合胆盐；利用PCR技术克隆出胆酸盐水解酶基因，翻译成相应的氨基酸，并利用生物分析手段对bsh 1基因以及其预测氨基酸序列进行了对比分析，结果表明，两株植物乳杆菌的bsh 1基因非常保守，且预测的氨基酸序列的相似性非常高，不低于98%。
关键词植物乳杆菌；胆盐水解酶基因：16S rDNA;酶活
随着人们生活水平的不断提高，高血压、糖尿病和冠心病等各种心血管疾病已经成为了人群高发病，世界卫生组织预测在未来的10年里，高胆固醇所引起的疾病将位居所有疾病死亡的人数之首。乳酸菌在食品生产中的应用具有悠久的历史，被认为是安全可靠的益生菌。早在1977年．Mann和Spoerry[4]发现长期饮用乳制品的非洲Masai人的胆固醇水平明显低于普通人。这一发现受到了广泛的关注，并对研究乳酸菌降胆固醇功能起到了带头作用。DE smet指出乳酸菌能够降低胆固醇与乳酸菌产的胆盐水解酶有密切相关。
胆盐水解酶( Bile salt hydrolase，BSH)是微生物生长、繁殖过程中产生的一种代谢产物。该酶是bsh基因编码的一种胞内酶，对氧气不敏感，适宜在微酸性环境下生长，能水解胃肠道中的结合态胆盐（牛磺胆酸盐和甘氨胆酸盐），将其转变生成氨基酸和非结合态胆酸，从而使血清中胆固醇含量降低。植物乳杆菌中同时存在4个bsh基因，分别命名为bsh l～bsh
4，bsh 1比其他3种bsh表现出更高的降解胆盐能力。通过对bsh基因组学方面的研究，让人们对BSH的功能有了进一步的认识。
对初步筛选得到的产胆酸盐水解酶的2株乳酸菌进行16S rDNA鉴定；并对两株菌所产BSH的活性进行了初步研究；利用PCR技术克隆出了编码BSH相应的基因片段，并进行了对比分析。为乳酸菌在降胆固醇方面的研究提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料
植物乳杆菌KLDS l.0317、植物乳杆菌KLDS1.0386，教育部乳品重点实验室保存。
1.2主要试剂与仪器
牛磺酸、甘氨酸、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐：Sigma公司；水和茚三酮、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝：天津基准化学试剂有限公司；试验用水为蒸馏水。
低温冷冻离心机：上海市离心机械研究所；超声破碎粉碎机：SCIENTZ公司；Biometra Tperson PCR仪：德国Biometra公司；紫外一可见分光光度计、厌氧箱：THERMO ELECERON CORPORATION公司。
1.3试验方法
1.3.1 菌种16S rDNA鉴定
将试验菌株KLDS l.0317和KLDS l.0386在MRS液体培养基中传代培养。利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取2株菌的总DNA。以所提总DNA为模板，通用引物27F( AGAGTTTGATCCTGGCTCA)，1492R( TACGGCTACCTTGTTACGACTT)进行PCR克隆。反应条件：95 ℃预变性4 min；94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延
伸7 min。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统观察结果。送由华大科技公司测序。测序结果同NCBI数据库中的相关菌株构建系统发育树。
1.3.2胆酸盐水解酶活力的测定
将菌株KLDS l.0317和KLDS l.0386在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧箱中培养24 h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，活化两代后，培养15 h至平台初期。配制20 mg/L的牛磺酸（牛磺酸）标准溶液，分别稀释成质量浓度为0，4，8，12，16和20 mg/L的溶液，取稀释液2 m L于试管中，加1 m L茚三酮显色液，漩涡震荡混匀，沸水浴15 min，冷却后加1 m L95%乙醇，充分混匀，测570 nm处吸光度。以牛磺酸（甘氨酸）质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。BSH酶活测定方法。
1.3.3蛋白质质量浓度的测定
称量1g牛血清白蛋白，溶解并定容到1L，配成1 g/L的标准溶液。稀释成质量浓度为0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3和0.35 g/L，分别吸取300μ L各浓度标准溶液和粗酶液至干净试管，加入3 m L蛋白质显色液，充分混匀，常温放置2 min后迅速测量在595 nm波长下的吸光度。
1.3.4 bsh 1引物设计及合成
从NCBI数据库获得多个植物乳杆菌胆酸盐水解酶
基因序列，用Primer premier 6.0软件设计bsh 1引物，
1.3.5bsh 1基因的克隆及检测
提取菌株的总基因组为模板，用合成的bsh 1引物进行PCR，反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s．46℃退火30 s．72℃延伸90 s，35次循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，后送由华大科技公司测序。
1.3.6bsh 1基因同源性分析
用Primer premier 6.0软件将BSH序列翻译成相应氨基酸，登陆NCBI数据库，通过Blast比对蛋白质相似性；利用HMMER功能鉴定保守域；并用Vector NTI 10进行蛋白同源性比对，分析BSH氨基酸序列之间的关系。
2结果与分析
2.1 菌种16S rDNA鉴定结果
将乳杆菌KLDS l.0317和KLDS l.0386的16S rDNA的测序结果提交到GENBANK，进行BLAST比对，结果表明，KLDS l.0317和KLDS l.0386与已发表的植物乳杆菌16S rDNA同源性为100%，说明这两株菌为植物乳杆菌，图1为2株菌的16S rDNA系统进化树。
2.2甘氨酸、牛磺酸标准曲线
如图2~图3所示，甘氨酸标准曲线方程为：y=0.042 8x+0.000 7，R2=0.999 4；牛磺酸标准曲线方程为：y=0.022x-0.001 2，R2=0.998;都有良好的线性相关性，可用于酶活测定。
2.3 比酶活测定结果
比酶活定义为每毫克蛋白质所含胆酸盐水解酶的单位(U)数，计算公式为式(1)。
2株乳杆菌KLDS l.0317和KLDS l.0386的比酶活测定结果如表1所示，都具有胆酸盐水解酶活性，而且都能降解牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐，但在甘氨脱氧胆酸盐中的水解能力更强，说明胆盐水解酶的水解能力与氨基酸侧链基团有密切关系。其中，KLDS 1.0386的比酶活明显高于KLDS 1.0317。
2.4胆酸盐水解酶保守区的比对
N-末端亲核水解酶家族在自然界广泛分布，这些酶的共同特征是N端都有一个半胱氨酸残基，酶被水解后，半胱氨酸即成为活性位点。BSH序列用Primerpremier 6.0软件翻译成相应蛋白，在NCBI上对BSH序列进行保守区序列比对，结果如图4所示，BSH属于N-末端亲核水解酶家族，其中半胱氨酸（Cys-1）的位点是十分保守的。
2.5 BSH氨基酸序列相似性分析
近年来，研究植物乳杆菌中BSH的居多，例如植物乳杆菌L．plantarum RK21、植物乳杆菌L．plantarumMBUL91、植物乳杆菌L-plantarum Lp-onlly和植物乳杆菌L．plantarum NCDC201等。通过Primer premier 5.0软件翻译成氨基酸序列进行比较，结果如表2所示。植物乳杆菌的BSH氨基酸序列相似性非常高，都在98%以上。
2.6 BSH氨基酸保守性分析
利用软件Vector NTI 10对植物乳杆菌KLDS l.0317和KLDS l.0386以及NCBI数据库中的植物乳杆菌P-8、植物乳杆菌WCFS 1和植物乳杆菌ST-III进行BSH保守性分析。橙色显示部分为5株菌共有的氨基酸序列，蓝色显示为部分拥有。可以看出5株菌保守性都较高，在70 b p以后的碱基序列部分2株菌与数据库已知的bsh 1序列相似性极高。
3结论与讨论
11试验采用bsh 1基因特异性引物对植物乳杆菌KLDS 1.0317和KLDS l.0386进行了PCR扩增，测序结果与NCBI上已发表的胆盐水解酶基因(EU822811)同源性为99%，故确认该2株菌含有胆盐水解酶基因，并对胆酸盐水解酶的核苷酸序列进行了分析。结果可知，胆酸盐水解酶序列十分保守；将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，发现植物乳杆菌KLDS 1.0317和KLDS 1.0386与植物乳杆菌RK21、植物乳杆菌MBUL91、植物乳杆菌Lp-onlly和植物乳杆菌NCDC 201的氨基酸相似度都很高，不低于98%;其氨基酸序列的保守性也很高。
21试验通过茚三酮比色法定量测得了2株植物乳杆菌的胆酸盐水解酶的比酶活，在两种底物下测得的酶活有差异。Begley和Gahan等提出，细菌的胆酸盐水解酶既能识别固醇侧链，又能识别氨基酸侧链，因此由结果可知，植物乳杆菌KLDS l.0317和KLDS1.0386能够识别氨基酸侧链，并且水解甘氨脱氧胆酸盐的能力强于牛磺脱氧胆酸盐，与Maire等研究表
明，大部分胆盐水解酶对底物的水解效率是牛磺酸低于甘氨酸的事实相符。
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