阿维链霉菌QL0827接合转移体系的建立

周华艳1，2，周长林1，窦洁1，方宏清2

1．中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009;2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100071

[摘要]  目的：建立工业生产菌株阿维链霉菌QL0827的接合转移体系：方法：优化接合转移条件，建立该菌株的接合转移体系；应用优化后的接合转移体系，将基因中断质粒导入该菌，定向敲除基因组上的序列；再将携带基因组上特定序列的整合型质粒和复制型质粒导入该菌体，建立该菌株的基因过表达体系。结果：相比标准的接合转移方法，优化后接合转移效率提高了近150倍，达到2.45x10-6；并成功地将pks3基因簇的部分序列删除。结论：建立了阿维链霉菌QL0827的接合转移体系。

[关键词]  阿维链霉菌；接合转移；基因敲除

[中图分类号]Q933[文章编号]  1009-0002( 2016)02-0188-04

 阿维菌素( ave。mectin)是由阿维链霉菌(Strepto-myces  avemitilis)产生的一类结构相似的十六元大环内酯齐墩果糖双糖衍生物，共有8个组分，分别为Ala.Alb、A2a、A2b、Bla、Blb、B2a和B2b，其中Bla的活性最高。阿维菌素及其重要的衍生物如伊维菌素(ivermectin)和多拉菌素(doramectin)，被广泛用于防治动植物线虫类和节肢动物类害虫，是主要的生物农药和兽药品种之一，具有很好的市场前景。阿维链霉菌QL0827是本实验室通过重金属诱变筛选方法获得的一株高产的阿维链霉菌突变株。应用传统的遗传诱变方法，对阿维菌素发酵效价的提高具有盲目性，同时后期的筛选工作量大。利用基因工程的方法可以克服这一缺点，实现对工程菌的定向改造。在对链霉菌进行基因改造的过程中，首先面临的问题就是要建立该菌株的基因转移系统。目前阿维链霉菌的遗传操作主要通过原生质体转化法、电转化法和接合转移方法来完成。接合转移可在一定程度上跨越宿主的限制性屏障，是国内外研究的热点。本研究确立了阿维链霉菌QL0827的接合转移体系，利用此方法将聚酮体合成酶基因pks3部分序列进行了删除，并将基因组上一段能够刺激阿维菌素表达的序列进行了过表达，为利用基因工程方法定向改造该工程菌奠定了基础。

1  材料和方法

1.1材料

 大肠杆菌DH10B（用于质粒构建）、大肠杆菌ET12567 (pU28002)（用于大肠杆菌-阿维链霉菌之间的接合转移）、工业生产菌株阿维链霉菌QL0827、大肠杆菌质粒pUC19、大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pKC1139和pSET152均由本实验室保存。

 卡那霉素、氯霉素、安普霉素和萘啶酮酸钠购自Sigma公司；氨苄西林钠购自华北制药股份有限公司；限制性内切酶购自Thermo公司；PCR酶购自Ta-KaRa公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

1.2基本操作

 阿维链霉菌培养和遗传操作；大肠杆菌-阿维链霉菌接合转移的方法并稍加改动；接合转移效率的计算方法；阿维链霉菌的发酵培养；大肠杆菌的培养和转化；大肠杆菌质粒提取参照天根生物技术有限公司质粒小量提取试剂盒的使用说明。

1.3 pks3生物合成基因中断／敲除质粒pKN-SLARl的构建

 以QL0827的总DNA为模板，PCR扩增长度为2096 b p的左同源臂SLI和2011 b p的右同源臂SR1；以质粒pKC1139为模板，扩增安普霉素抗性基因A;用电转的方法将质粒pKC1139的安普霉素抗性基因aac（3）IV置换成新霉素抗性基因neoR，构建质粒p KN;将片段SL1、A、SR1和质粒p KN酶切后回收片段和骨架，再用T4DNA连接酶连接，即构建成pks3生物合成基因簇打靶质粒pKN- SLARl。

1.4特异性序列S4过表达质粒pKC-S4和pSET-S4的构建

 阿维链霉菌基因组上的一段特异性序列S4（EMBL接受号：AF440828）能够刺激阿维链霉菌中阿维菌素的表达。首先以QL0827的总DNA模板，PCR扩增长度为3.5 kb的片段S4，用EcoR I /Xba1分别双酶切片段S4、质粒pKC1139和质粒pSET152，用T4DNA连接酶将S4与质粒连接，构建成该序列的过表达载体pKC-S4和pSET-S4。

1.5  高效液相色谱(HPLC)测定阿维菌素B la组分

 取阿维链霉菌发酵液，向发酵液中加入2倍体积的甲醇，振荡均匀后于超声波清洗器中超声20min，4℃静置5h后再次离心，取上清液稀释至合适浓度后用HPLC测定阿维菌素B la组分的含量（流动相为甲醇：水=85:15，流速为1 m L/min，检测波长为246 nm)。

2结果

2.1  阿维链霉菌QL0827对抗生素的敏感性

 为了建立一套有效的转化系统，首先研究了阿维链霉菌QL0827对各种抗生素的耐受性。实验结果显示，这一菌株在2xYT液体培养基中对硫链丝菌素、新霉素、安普霉素、潮霉素和氯霉素敏感；在MS培养基中对上述5种抗生素也显示出相同的敏感性。参考其他阿维链霉菌菌株遗传筛选标记，本实验选定安普霉素作为筛选标记。研究结果显示，在MS抗性平板中，浓度依次为5、1、5、5和10μg/m L的安普霉素、新霉素、硫链丝菌素、潮霉素和氯霉素即可完全抑制阿维链霉菌QL0827的生长（表2）。选用50μg/m L安普霉素作为结合子筛选的浓度。

2.2阿维链霉菌QL0827接合转移系统的建立

2.2.1  MS培养基中Mg Cl2浓度的确定MS培养基中的MgCl2浓度可以影响接合转移的效率。将孢子热激10 min，受体菌和供体菌按照1:1的比例混合后，涂布在MgCl2浓度分别为0、10、20、30、40、50m mol/L的MS培养基上，28℃培养15～16 h后覆盖萘啶酮酸和安普霉素溶液。由图1A可看出当MgCl2的浓度为30 m mol/L时，接合转移效率最高。选定30m mol/L最为MS培养基中Mg Cl2的最佳浓度。

2.2.2热激时间的确定不同的热激时间可以影响

接合转移效率。分别于50。C热激0、6、8、10、12、14min，受体菌和供体菌按照1：1的比例混合后，涂布在Mg Cl浓度为30 m mol/L的MS培养基上，280C培养15~16 h后覆盖萘啶酮酸和安普霉素溶液。结果显示（图1B），在热激10 min的条件下可以长出较多的转化子。选定10 min为最佳热激时问。

2.2.3供体菌和受体菌的比例  不同的供受体菌比例可以影响接合转移效率。将孢子热激10 min，供体菌与受体菌分别按照1：10、1：100、10:1、100:1、1：1的比例混合后，涂布在Mg Cl,浓度为30 m mol/L的MS培养基上，28C培养15—16 h后覆盖萘啶酮酸和安普霉素溶液。依据图IC的结果，选定1:1作为最佳的供受体比例。

2.3 pks3基因的删除和序列S4的过表达

2.3.1  质粒pKN-SLARl的转化和双交换突变株的筛选将在大肠杆菌DH10B中构建的质粒p KN-SLAR1转化大肠杆菌ET12567(pU28002)，再通过大肠杆菌-链霉菌之间的接合转移，将质粒转入阿维链霉菌QL0827;挑选具有安普霉素抗性的菌株，连续3次在280C培养条件下生孢传代后，挑选只有安普霉素抗性无卡那霉素抗性的菌株于液体培养基中振荡培养后提取总DNA;分别以提取的总DNA为模板，以SL15/SR13为引物进行PCR扩增。如图2所示，2、5、6号能够扩增出5.5 kb左右的条带，为pks3基因缺失突变株QL0827-S1;其余不能扩增出5.5 kb的条带，为阴性菌，阳性率为30%。同时，将PCR产物回收后测序，结果正确。

2.3.2转化质粒pKC-S4和pSET-S4到阿维链霉菌QL0827中  将在大肠杆菌DH10B中构建的质粒p KC- S4和p SET- S4转化大肠杆菌ET12567(pU28002)，再通过大肠杆菌-链霉菌之间的接合转移，将质粒转入阿维链霉菌QL0827;挑选具有安普霉素抗性的菌株多次在安普霉素抗性的MS培养基上生孢传代，再次挑选具有安普霉素抗性的菌株保存。此时获得的菌株为序列S4过表达菌株QL0827( pKC-S4)和QL0827(pSF,T-S4)。

2.3.3  QL0827. QL0827 (p KC- S4)、QL0827( p SET-S4)和QL0827- S1的发酵结果  将验证后的QL0827.QL0827 (pKC-S4)和QL0827 (p SET- S4)与QL0827- S1分别进行摇瓶发酵，并进行HPLC检测。图3A结果显示，QL0827.QL0827 (pKC-S4)、QL0827( pSET-S4)和QL0827-SI产生阿维菌素组分B la的效价分别为4645.35、4463.145、5370.83和1326.49 mg/L，与出发菌株QL0827相比，DNA片段多位点插入突变株QL0827( pSET-S4)的阿维菌素中组分B la的效价提高了15.61%;QL0827(pKC-S4)与QL0827相比稍有下降；QL0827-S1发酵液中B la组分的效价下降了71.44010。QL0827-S1发酵液的菌浓也比QL0827的菌浓低了26.70%（图3B）。

3讨论

 接合转移作为一种基因转移手段已在多种链霉菌中得到应用，它不仅可以避开胞外核酸酶，使DNA免遭核酸酶的降解，在某种程度上克服宿主对外源DNA的限制性障碍，而且操作程序也相对简单，是目前链霉菌遗传转化中广泛使用的一种基因转移方法。链霉菌不同菌属之间差异很大，即使相同种属，不同变种之间的转化方法也存在一定程度的差异。本实验中的阿维链霉菌属于高产菌株，应用电转化法和原生质体转化法都不能将质粒成功地转入菌体，推测可能和菌种自身的限制修饰系统以及原生质体的再生能力有关。另外，应用标准的链霉菌接合转移方法转化效率也极低( 1.67x10-7)。本实验通过优化接合转移过程中的关键因素，建立了一套相对高效的大肠杆菌-阿维链霉菌QL0827接合转移体系。在接合转移体系中，阿维链霉菌QL0827的最适供受体菌比例是1:1，而链霉菌7 69的最适供受体菌的比例为1:10，诺尔斯链霉菌Xinao-4最佳供受体菌的比例为1：100。阿维链霉菌QL0827孢子在500C热激10 min时接合转移效率最高，这与诺尔斯链霉菌Xinao-4 -致，而龟裂霉素产生菌龟裂链霉菌的孢子在400C下热激10min接合转移效率最高。当用于MS培养基中MgCl2的浓度为30 m mol/L时，阿维链霉菌QL0827有最高的接合转移效率，这与龟裂链霉菌一致，阿维链霉菌高产菌株ATCC31780和阿维链霉菌野生型ATCC31267通常使用的MgCl2的浓度为10 m mol/L

或者采用原生质体转化法，诺尔斯链霉菌Xinao-4的最佳MgCl2为40 m mol/L。采用最优的转化条件时阿维链霉菌QL0827的接合转移效率为2.45x10-6，运用此条件也成功地将质粒pSET152转入QL0827。虽然低于诺尔斯链霉菌Xinao-4和龟裂链霉菌，但该接合转移效率足够进行基因敲除等遗传操作。我们运用该接合转移条件，成功地将构建的供体质粒转入阿维链霉菌QL0827，并将pks3基因簇的部分序列进行了敲除，过表达了一段能够提高阿维菌素产量的DNA序列。本研究建立的阿维链霉菌QL0827基因敲除体系为后续探讨该菌种的次级代谢产物合成和代谢调控奠定了重要基础。