利用自裂解肽T2A共表达猴B病毒糖蛋白g B和g D

徐刚1，周小军2，宋禾1，王进2，法云智2，叶华虎2

1．成都农业科技职业学院畜牧兽医分院，四川成都620038；2．军事医学科学院实验动物中心，北京100071

[摘要]  目的：探讨自裂解肽T2A对猴B病毒g D和g B蛋白共表达的可行性。方法：利用一点褐翅蛾病毒(Ta V)的2A元件(T2A)连接猴B病毒膜蛋白g D和g B基因，构建多顺反子表达质粒，制备CHO-S工程细胞，采用Western印迹和ELISA检测蛋白表达及重组蛋白的免疫学特性。结果：g D和g B蛋白实现了共表达且保持了独立和完整的分子结构，但g B的表达水平明显低于g D; ELISA结果显示，单独表达的g D和g B以及共表达产物都能与B病毒阳性血清反应，但共表达产物的反应强度高于单独表达的g D和g B;重组蛋白经变性处理后，g B蛋白的吸光度值降幅最大。结论：自裂解肽T2A能够实现不同分子共表达且保持独立和完整的分子结构；共表达猴B病毒g D和g B分子有利于提高抗体检测的敏感性。

[关键词]  自裂解肽T2A；g D；g B；猴B病毒

[中图分类号]  Q78; R392.1  [文章编号]  1009-0002(2016)02-0163-05

 猴B病毒(B virus，BV)是a单纯疱疹病毒属家族成员，也是当前影响实验猴质量的重要病原之一。在人工繁殖的非SPF实验猴群中，B病毒感染率囚管理水平和动物年龄不同波动于20%～90%之间。另外，B病毒灭活疫苗的低保护力以及动物感染通常缺乏明显的临床表现，致使目前尚未建立猴B病毒防控的有效手段。

 g B和g D蛋白是疱疹病毒最重要的膜蛋白分子。对单纯性疱疹病毒(HSV)的研究发现，g B和g D与细胞表面受体特异性结合，启动膜融合和病毒入侵，是病毒感染的主要途径。同时，g B和g D在该家族病毒成员中相对保守，也是机体免疫应答的重要靶点。在猪伪狂犬病病毒( PRV)血清抗体检测中，g B和g D被认为是最敏感的抗原。G B和g D在猴B病毒感染及机体免疫应答中同样发挥重要作用，早期研究显示，g B和g D抗体是B病毒感染后最

早产生且效价最高的抗体；以g B和g D基因制备的DNA疫苗对免疫动物有较好的保护作用。

 但是，目前在g B和g D重组蛋白制备过程中，原核表达产物通常为包涵体，难以获得与天然结构一致的重组蛋白；瞬时表达产物又存在量的限制等问题。鉴于此，我们利用真核达系统并结合近年来新发现的自裂解肽2A技术，分别制备了表达g B和g D以及共表达g B和g D的工程细胞株，建立了重组蛋白制备的生产流程；在此基础上，对重组蛋白的免疫原性和反应原性进行了探索，旨在为B病毒的防控奠定基础。

1 材料和方法

1.1材料

 CHO-S细胞和pcDNA3.1表达载体由军事医学科学院生物工程研究所胡显文博士惠赠；大肠杆菌DH5a、卡那霉素等购于博迈德生物公司；Lipofectin2000、G418、CD Forti CHO培养基、抗结团试剂(anti-clumping agent)、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、DMEM/F-12(1:1)、胎牛血清(FBS)等购于Gibco公司；HRP标记的兔抗猴IgG二抗购于Sigma公司；钻亲和层析柱为GE公司产品。

1.2表达载体构建

 以本室保存的质粒pGMT-BV-g B（包含BV-g B的完整基因及优化密码子序列）和pGMT-BV- g D（包含BV-g D除跨膜区外的所有基因优化密码子序列）为模板，PCR扩增g B基因的胞外区序列（上下游引物分别为BV-g B-F和BV-g B-R），将其插入载体pcDNA3.1的多克隆位点，形成表达载体pcDNA3.1-BV-g B；同时，将BV-g D-F和BV-g D-R l扩增片段插入pcDNA3.1多克隆位点，形成表达载体pcDNA3.1-BV-g D。将BV-g D-F和BV-gD-R2扩增片段插入pcDNA3.1多克隆位点，形成中间载体pcDNA3.1-BV- g D-I;最后，将T2A肽与BV-g B融合基因插入pcDNA3.1-BV-gD-I载体，形成pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB表达载体。参见图1；引物及序列见表1。

 将重组质粒转化大肠杆菌DH5a，通过氨苄西林筛选及测序鉴定，最后利用无内毒素的质粒提取试剂盒制备表达载体pcDNA3.1-BV-gB、pcDNA3.1-BV-g D和pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB.

1.3  高表达工程细胞筛选

 CHO-S细胞复苏后先培养于含10% FBS的D/F培养基中，传代2—3次后接种于24孔板，待细胞长成单层；按Lipoferctin 2000的使用说明将3种表达载体转染细胞，转染细胞首先在含G418（800 μg/m L）的培养基中加压连续筛选3周，每4～5 d换液一次；待细胞呈明显生长状态后，再将G418的浓度分别提高到1500μg/m L，继续加压筛选3～4周，直到细胞生长状态良好；消化收集抗性细胞，用无抗性的培养基无限稀释并接种于96孔板（每孔细胞数量0.5～2个），待细胞出现小集落时，更换为无血清培养基（CD FortiCHO中加入抗结团试剂和4 m mol/L谷氨酰胺），继续在370C、5% CO2条件下培养，直到细胞铺满孔的一半以上；取细胞培养上清包被ELISA板，用稀释至1/10的猴B病毒阳性血清进行ELISA检测，利用ELISA结果挑选表达量最高的细胞克隆。

1.4重组蛋白鉴定

将高表达克隆细胞先在培养瓶中培养，待细胞密度达到100～200万/m L时转入摇瓶培养，每2d按起始体积的5%~10%加入浓缩培养基(CHO CD E f-ficientFeed B)；同时每2d检查细胞密度和活力，当细胞密度达到千万级且活率为70%—80%时终止培养；离心收集细胞上清，利用SDS-PAGE和Western印迹鉴定蛋白的表达。

1.5  重组蛋白的ELISA评价

 用碳酸盐缓冲液( pH9.6)将细胞培养上清中的总蛋白稀释到5μg/m L，包被ELISA板，每100μL，4℃放置过夜；室温下用含10%FBS和0.5%水解酪蛋白的PBS封板1 h；加入稀释至1/10的猴B病毒阳性血清和阴性血清(稀释液为含10% FBS的PBS)，室温下放置1 h；用含0.08% Tween-20的PBS洗涤3次，每次5 min;加入稀释至1/25000的HRP标记的兔抗猴IgG二抗(稀释液为含10%兔血清的PBS)，室温下放置1 h；用PBST洗涤3次，加入100

μL单组分TMB显色液（湖州英创生物科技公司），室温下避光放置15～20 min，最后加入50 μL 1 mol/L的硫酸终止显色，在酶标仪上读取D值，测量波长为450 nm，参比波长为620 nm。

2结果

2.1 3种表达载体的构建

 利用3对引物分别从质粒pGMT- BV-g B和pGMT-BV-g D上扩增得到含不同酶切位点的g B和g D基因片段，大小分别约为2300和1050 b p(图2)。用Xho I和EcoR I双酶切回收片段和质粒pcDNA3.1（一），连接并转化大肠杆菌DH5a，抗性筛选后提取质粒，测序结果显示pcDNA3.1-BV-gB和pcDNA3.1-BV-gD序列正确。将pcDNA3.1-BV-gD及BV-T2A-gB-F和BV-T2A-gB-R扩±曾产物分另0用EcoR I和BamH I双酶切，同样经过回收、连接、转化、质粒提取和测序等过程，得到表达载体pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB。

2.2高表达工程细胞的构建及筛选

 质粒pcDNA3.1- BV- g B、pcDNA3.1- BV- g D和pcDNA3.1- BV- gD-T2A- g B分别转染CHO-S细胞后，经过中压（800μg/m L G418）和高压(1500 μg/m L G418)筛选及细胞的单克隆化过程，分别得到42、58和31个单克隆细胞集落（图3）；ELISA检测显示，与BV阳性血清反应的单克隆细胞分别为4、34和22株。

2.3  重组蛋白的Western印迹鉴定

 根据ELISA结果，分别从3种表达不同外源蛋白的T程细胞中各挑选1株高表达细胞(简称B3、D12、DB6)进行流加培养，培养上清用于Western印迹检测。结果显示，B3在M r约iooxi03处出现单一带，D12在M r约50Xl03处出现杂交带，而DB6出现2条杂交带。表明pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB中的g B和g D分别得到分泌性表达（图4）。另外还可看出，g B无论是单独表达或与g D共表达，其表达量都低于g D蛋白。

2.4重组蛋白与猴血清的反应性评价

 测定3种细胞培养上清的总蛋白含量后稀释至5 μg/m L，并与等量的碳酸盐缓冲液(pH9.6)混合，包被ELISA板（每孔100 VL），分别用B病毒阳性血清池（10份B病毒阳性猴血清等量混合）和阴性血清池（10份B病毒阴性猴血清等量混合）进行检测，结果发现3种细胞上清都能与B病毒阳性反应，且都不与阴性血清反应。其中，DB6的3个重复孔的D值最高，为1.533+0.052; B3的D值次之，为1.161±0.065；D12的D值最低，为0.724+0.063；而与阴性血清反应的D值均小于0.1（图5）。提示g D和g B共表达能提高抗体检测的敏感性。

 将细胞上清变性处理（煮沸5～8 min）后再包被ELISA板，并用阳性血清池和阴性血清池进行检测，结果发现变性蛋白与阴性血清反应后的D值变化不明显，而阳性血清的的D值都出现明显下降。其中D12的降幅较小，由非变性时的0.724+0.063降为0.500+0.034; B3的降幅最大，由非变性时的1.161±0.065降为0.574+0.03。提示g B蛋白的空间表位在诱导机体免疫应答中发挥重要作用（图5）。

3讨论

 B病毒以猴为自然宿主，但对人的致死率超过70%。当前，由于缺乏对抗B病毒的特效药物，快速准确检测抗体是防控该疾病的主要手段。检测中采用的抗原主要是B病毒或其他高度同源的疱疹病毒（如SA8、HSV等），因而存在安全性和准确性等问题。鉴于重组蛋白在病原研究及防控中的重要意义，我们利用细胞工程并结合近年来新发展的自裂解肽2A技术，实现了猴B病毒g B和g D蛋白的分别表达和共表达。结果表明，单独表达时，g D的表达效率和水平明显优于g B蛋白，在42个BV-g B的细胞克隆中，培养卜清能与BV阳性血清发生明显反应的仅有4株细胞；而58株BV-g D 工程细胞中，24株可在培养上清中检测到g D表达。Werstern印迹结果也显示，2种最高表达水平的细胞在培养时间和密度相似时g D杂交条带明显强于g B。g D蛋白表达水平较高是由于筛选到高表达细胞株，亦或是基因、转录、翻译及翻译后的成熟过程所致，目前尚不清楚。

 对具有自裂解功能的细菌和病毒的研究发现，裂解肽上游和下游基因在转录时形成完整的mRNA分子，但在翻译时，由于裂解肽的存在，转录因子在上游基因翻译完成后，不会从mRNA上脱落，而是启动下游基因翻译。因此，裂解肽上游和下游基因在转录水平上是平衡的。利用自裂解肽进行多基因共表达的实验研究也证实，上游和下游基因的转录水平是一致的。而本实验以自裂解肽为linker，将B病毒g D和g B基因共表达，但其蛋白表达水平在Western印迹检测中差异明显，说明翻译水平及翻译后的成熟过程可能是导致g B低表达的主要原因。

 我们在利用T2A构建g D和g B共表达载体时，在上游C端加入了Ser-Gly-Ser-Gly序列，该序列被认为能提高2A肽的剪切效率、促进基因表达。而Western印迹表明，共表达细胞中只出现g D和g B杂交带，在聚合蛋白处没有杂交条带，表明该系统中的剪切效率是完全的。

 对重组蛋白的血清学评价实验表明，单独表达的g D和g B及二者的共表达产物都能与B病毒阳性血清反应，但三者的反应强弱不同，共表达产物反应最强，g D的反应最弱。Perelygina的早期研究也证实，B病毒重组g B蛋白在血清抗体检测中的敏感性最高17I。在其他疱疹病毒的研究中，人们也发现g B蛋白是最理想的抗体检测抗原。而本实验中，共表

达产物与阳性血清的反应性不仅明显强于g D，同时也强于g B（D值为1.533+0.052 vs 1.161+0.065，说明二者可能存在互补性。我们前期在B病毒其他重组蛋白的研究中也发现此现象，提示在利用重组蛋白检测B病毒抗体时，多分子联合使用可能是提高检测效率的方向。另外，3种重组蛋白经加热变性处理后，与阳性血清的反应性明显减弱，其中以g B蛋白的D值降幅最大，而g D的降幅较小。我们对目前被证实的g B和g D线性表位肽进行了比较，发现g D上的表位(362GPARRGAPY370）与B病毒阳性血清反应最强（结果未给出）。G D上由于存在优势线性表位，可能是变性蛋白D值降幅较小的原因；而g B变性蛋白较大的降幅，说明g B分子的空间表位是优势表位。

 总之，我们利用自裂解肽2A实现了B病毒g D和g B的共表达，日+重组蛋白保持了独立、完整的结构，为猴B病毒检测及分子机制研究提供了新思路。