利用线性表达框高通量表达人源单克隆抗体

张梦雄，杨志新，王荣，陆健异，夏炳辉，周晓巍，黄培堂

军事医学科学院生物工程研究所，北京100071

[摘要]  目的：建立不通过克隆步骤高通量表达来源于人单个B细胞的抗体轻、重链基因的方法。方法和结果：PCR扩增3个末端重叠的DNA片段，即①CMV启动子和编码抗体引导区序列的片段；②抗体IgG1重链恒定区序列和牛生长激素(BGH)poly(A)信号序列，轻链I g K恒定区序列和BGH poly(A)信号序列，轻链I gλ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列；以及③抗体基因可变区序列VHs V k或V、。3个片段通过重叠延伸PCR构建全长线性片段即线性表达框，将此来源于人单个B细胞的配对的抗体轻、重链线性表达框共转染293E细胞，72 h收集上清检测到表达的抗体。结论：构建的抗体基因线性表达框是无须克隆，快速高通量表达抗体基因进行筛选．分析的策略。

[关键词]单克隆抗体；单个B细胞；抗体基因；重叠延伸PCR;线性表达框

[中图分类号]  Q78; R392.1 [文章编号]  1009-0002(2016)02-0158-05

 抗体由2条相同的重链和2条相同的轻链构成，抗体轻、重链基因具有多样性，主要由V、D、J基因的突变和重组所决定。功能性VH的基因片段约50个，编码重链可变区的CDR1和CDR2;DH基因片段位于VH和JH基因簇之间，约25个，编码大部分CDR3;JH基因位于DH下游，约有6个功能性片段，编码部分CDR3和CDR4。轻链的功能性V k的基因片段约40个，J k约5个；而功能性Vλ的基因片段约40个，Jλ约4个。正是由于抗体具有多样性的特点，才能使人的免疫系统识别各种各样的抗原。近年来，单克隆抗体在病原体致病机理研究、蛋白质结构研究及被动免疫治疗方面都发挥着越来越重要的作用。当人体受到病原体感染或接种疫苗后，就会产生大量针对特定抗原的淋巴细胞，通过扩增分离出的单个B淋巴细胞，就可以获得大量轻、重链配对的抗体基因，这就是单个B细胞技术。与其他技术相比，通过单个B细胞技术可以获得全人源天然配对的单克隆抗体，而且获得抗体的效率很高。但是单个B细胞技术需要克隆表达大量序列未知的抗体基因，才能进行进一步的筛选和鉴定，这部分工作费时费力，大大降低了该技术的效率。因此，需要一种高效的瞬时表达抗体基因的方法，以便高通量筛选抗体。理论上讲，表达重组的抗体基因只须具备转录翻译相关的必要元件即可，这些元件包括CMV启动子、抗体引导区序列、抗体轻、重链恒定区和poly( A)信号序列，以及通过PCR扩增出的抗体轻、重链的可变区基因等。通过一步PCR将抗体表达所需的各个元件构建成一个完整的线性表达框，再将配对的轻、重链线性表达框共转染到真核细胞中进行瞬时表达，就可以获得完整的功能性抗体分子。在本研究中，我们采取上述方法，表达了从肾综合征出血热康复期患者外周血B细胞中获得的抗体基因。

1  材料和方法

1.1材料

 293E悬浮细胞，分别表达抗体重链、K轻链和入轻链的质粒pTSEGln-S、pTSEK-S、pTSEL-S由刘志刚博士惠赠；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；PCR热启动酶Transtar购自北京全式金生物技术有限公司；去内毒素小提中量试剂盒购自Ome-ga公司；Freestyle 293无血清培养基购自Gibco公司；转染试剂fectoPRO购自Polyplus公司；HRP标记的羊抗人二抗购自Earth公司；引物和测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2从单个B细胞中扩增抗体可变区基因

 通过RT-PCR和巢式PCR两步扩增编码抗体轻、重链可变区的基因，扩增反应在96孔PCR板上进行，每孔中有一个从人外周血中分离的单个B细胞。RT-PCR反应在每孔中加入一步RT-PCR试剂和扩增重链可变区、K轻链可变区、入轻链可变区的上、下游引物的混合引物，在30μL反应体系中进行扩增。第二步巢式PCR以RT-PCR反应的产物为模板，建立3个反应体系，分别扩增重链可变区基因、K轻链可变区基因、λ轻链可变区基因，最后以巢式PCR产物为模板，以表1所列引物扩增用于构建线性表达框的可变区基因片段。

1.3构建线性表达框

 线性表达框包括3部分，一是启动子及抗体引导区（P区），二是抗体可变区编码区（V区），三是恒定区编码区及poly(A)区（C区）；表达重链和轻链使用相同的启动子和引导区，重链、K轻链和入轻链分别有不同的恒定区。以表达抗体重链的表达质粒pTSEGln-S为模板，以pTSE-pCMVf、pTSE -pCMVr为引物扩增CMV启动子一抗体引导区片段（PCR反应条件：94℃预变性4 min，以94℃变性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸1.5 min进行25个循环，72℃再延伸10 min，4℃保温30 min）；以pTSEGln-S、表达K轻链的质粒pTSEK-S、表达入轻链的质粒pTSEL-S为模板，分别以pTSE-hpolyAF、pTSE-kpolyAF、pTSE-LpolyAF为正向引物，以pTSE-polyAr为反向引物扩增相应载体的恒定区-BGH poly(A)片段（PCR反应条件：94℃预变性4 min，以94℃变性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸2 min进行25个循环，72℃再延伸10 min，4℃保温30 min）；表达汉城病毒抗体18D4（K轻链）时，分别以带有该抗体轻、重链可变区编码序列的质粒为模板扩增可变区片段；未知抗体可变区片段来源于1.2。V片段 5’端与P片段3’端有24个重叠核苷酸，V片段3’3端与C片段5’5端有24个重叠

核苷酸。再以这3个片段为模板，P片段、可变区片段、C片段按摩尔比1:3:1混合，以pTSE-pCMVf和pTSE-polyAr为引物，通过重叠延伸PCR扩增完整的线性表达框（PCR反应条件：加入引物之前，先以94℃4 min、50℃ 5 min、72℃10 min进行1个循环，然后加入上下游引物，94℃预变性4 min，以94℃变性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸4 min进行25个

循环，72℃再延伸10 min，4℃保温30 min）。

1.4线性表达框转染293E细胞瞬时表达抗体

 将轻、重链配对的重链表达框和轻链表达框各250 n g共转染293E细胞表达抗体，转染时细胞密度为2x105/m L，转染及细胞培养在24孔细胞培养板中进行，每孔含560 VL细胞，150 r/min、5% CO2、370C培养48～72 h，1000 r/min离心5 min，收集细胞培养上清，经10% SDS-PAGE和Western印迹（HRP标记的羊抗人Ig G）检测表达产物。同时，以转染抗体表达质粒作为对照。

1.5  18D4抗体的特异性检测

 用包被液稀释灭活的汉城病毒L99，至终浓度（蛋白浓度）为10μ g/m L，每孔100μL于4℃包板过夜。PBST漂洗3次，每孔加入300μL 2%的BSA，370C封闭2h，再用PBST漂洗3次，每孔加入100μL收获的表达上清或稀释液，370C孵育2h，PBST漂洗3次，每孔加入100 μL HRP标记的羊抗人IgG抗体（1:5000稀释），370C孵育1.5 h，PBST漂洗3次，加入底物OPD显色10～15 min，加1 mol/L硫酸终止，在酶联仪上读取D4。2nm值。

1.6  通过ELISA对通量表达的抗体定量

 为了检测抗体是否表达并对细胞培养上清中的抗体进行定量，以羊抗人IgG抗体500 ng/孔包板，其他同18D4抗体的特异性检测。

2结果

2.1  从单个B细胞中扩增抗体可变区基因

 从单个B细胞中扩增抗体基因，由于基因序列是未知的，因此第一步RT-PCR在每一个反应体系中都需要加入多个引物的混合物，包括扩增不同亚型重链、K轻链、入轻链的引物，反应产物直接用作第二步巢式PCR反应的模板。在巢式PCR反应中，重链、K轻链、入轻链是分别扩增的，琼脂糖凝胶电泳可以检测到相应大小的片段。第三步PCR反应的目的是在片段的两端引入与线性表达框中其他片段的重叠区域，这一步只扩增轻、重链配对的抗体可变区基因片段（图1）。

2.2线性表达框构建

 线性表达框的结构如图2A所示。以质粒载体为模板[ pTSEGln-S、pTSEK-S、pTSEL-S含抗体轻、重链的CMV启动子一引导区段及恒定区-poly( A)段]，分别扩增出抗体轻、重链的CMV启动子一引导区段及恒定区-poly( A)段，轻、重链的CMV启动子一引导区段约为1260 b p，轻、重链的恒定区-poly( A)段分别约为980和1650 b p（图2B）。将从B细胞获得的天然配对的轻、重链抗体可变区基因片段与胶回收后对应的轻、重链CMV启动子一引导区段及恒定区-poly(A)段通过重叠延伸PCR构建成完整的线性表达框。构建的线性表达框重链约3250 b p，轻链约2600 b p（图2C）。通过此方法构建了130对配对的轻、重链线性表达框。

2.3  不通过克隆表达抗体VH和VL基因

 通过重叠延伸PCR构建的抗体轻、重链的线性表达框含有抗体表达所必需的表达元件，包扩CMV启动子序列，抗体轻、重链引导区序列，可变区，恒定区及BGH poly(A)信号肽序列。为确定线性表达框是否可以表达出具有活性的抗体，我们将实验室前期制备的一个针对汉城病毒具有特异性的抗体基因18D4构建到线性表达框中，将含有该抗体轻、重链基因的质粒和线性表达框在相同的条件下分别转染293E细胞进行表达，用羊抗人IgG抗体进行Western印迹检测，2种表达方式都检测到抗体轻、重链2条带，相对分子质量分别为55X103和25x103（图3A）。ELISA检测表明分别用线性表达框和质粒转染293E细胞在24板中表达18D4的表达量无显著差异，上清中抗体含量分别为1.2和1.4 μg/m L(图3B)。 

为验证线性表达框表达出的抗体是否具有功能性，我们把线性表达框表达、质粒表达及纯化后的18D4以及一个无关抗体20E3稀释到相同浓度1.2μg/m L，通过ELISA检测了线性表达框和质粒表达的18D4抗体是否对灭活的汉城病毒L99具有相同的结合特异性。结果显示2种表达方式表达的18D4抗体对抗原的结合特异性基本一致，说明线性表达框所表达出的抗体不会改变其原有的活性（图3C）。

2.4  表达从人外周血单个B细胞中分离的抗体VH和VL基因

 将构建的130对轻、重链配对的线性表达框转染24孔板中的悬浮细胞293E，150 r/min、5% CO2、37C培养72 h，离心收集上清，分别通过Western印迹和ELLSA进行鉴定，共表达出120个抗体，线性表达框表达抗体率为92%左右，Western印迹分析显示表达的抗体具有完整的轻、重链，表达的抗体浓度为2～4 μg/m L的占10%左右，1～2 μg/m L的占60%左右，0.4～1μg/m L的占30%左右（图4），结果显示不同抗体间表达量存在一定的差异，可能与抗体本身的结构相关。

3讨论

 体外表达抗体基因，需要将抗体基因克隆到真核细胞表达质粒中，表达质粒上有CMV启动子、抗体引导区序列、poly( A)信号序列、抗体重链或轻链恒定区序列。利用质粒载体表达抗体需要构建重组质粒，筛选阳性克隆，进行序列分析等，耗时长，TJ作量大，难以进行高通量表达、筛选等工作，从而成为单个B细胞制备抗体技术的瓶颈。本研究利用分别带有上述原件的有重叠序列的3个DNA片段，通过一步PCR构建出线性的抗体基因表达框，不必将抗体轻、重链基因克隆进表达载体，就可以实现抗体的表达。我们采用这种方法表达了针对汉城病毒L99株具有特异性的抗体18D4，并表达了从肾综合征出血热康复期患者外周血B细胞获得的抗体基因。

 本研究所构建的抗体基因线性表达框包含了表达功能性抗体所必需的所有重要原件，包括CMV启动子、抗体引导区序列、Ig G1重链恒定区或轻链恒定区、poly(A)序列，以及通过PCR扩增出的抗体轻、重链的可变区基因。虽然不同来源的抗体基因序列会有所差异，但可以根据不同物种抗体基因序列特征设计不同的扩增引物，因此本实验所建立的方法不仅适用于表达人源单克隆抗体，还可用来表达鼠源、马源、猴源等非人源单克隆抗体。由于IgG1是最普遍的抗体亚型，考虑到方法的通用性，抗体重链表达框的恒定区选择了IgG1的恒定区，而且有研究表明嵌合的IgG1抗体具有与亲本抗体相同的特异性和相近的亲和力。另外在本实验中，利用线性表达框瞬时转染293E细胞表达的18D4抗体与用质粒表达的表达量基本相同，这也为筛选针对特定抗原的特异的中和抗体提供了更加高效便捷的手段。

 利用本研究建立的线性表达框的方法，结合单细胞RT-PCR技术，从肾综合征出血热康复期患者外周血中分选出单个B细胞，到表达出单克隆抗体，只用了5d的时间，很大程度上加快了实验进程。更重要的是，通过本实验还证明我们可以做到高通量扩增抗体基因并表达出相对应的抗体，为抗体高通量筛选和鉴定提供了理论基础和技术支持。