响应面优化微波辅助法提取小蓟绿原酸的工艺研究

 王丽萍，徐传远，常丽新，田亚红

 华北理工大学生命科学学院(唐山063000)

摘要  以小蓟为原料，采用微波辅助法提取绿原酸。在单因素试验的基础上，以液料比、微波功率和提取时间为试验因素，以小蓟中绿原酸得率为响应值，利用响应面分析法，确定了绿原酸提取的最佳工艺参数为液料比26：1(m L/g)、微波功率550 w、提取时间95 s，在此条件下从小蓟中提取绿原酸的得率为2.81%，与预测值接近。

关键词  响应面；小蓟；绿原酸：微波辅助

  绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利胆等多种功效。近年来发现绿原酸类物质有抗癌、抗艾滋病的作用，可作为先导设计开发抗癌、抗艾滋病药  物。同时，绿原酸还可作为食品保鲜剂、食品添加剂、植物生长激素及一些高级化妆品的添加剂等，是食品、药品、化妆品等工业的重要原料。因此，绿原酸被称为植物黄金。

 小蓟（Cirsium setosum）又名刺蓟菜、刺儿菜、青青菜、萋萋菜等，多年生草本，分布于中国大部分地区。小蓟性凉、味甘、苦，归心、肝经，具有凉血止血、祛瘀消肿功能，为血淋、尿血要方“小蓟饮子”之君药。现代医学研究表明，小蓟还具有抗肿瘤、降血压、治疗败血症等功效。小蓟中的有效成分比较复杂，含黄酮类、有机酸类、甾体类等化合物，其中绿原酸是小蓟促进血液凝固，止血的主要功效成分之一。目前已有研究者测定了不同产地的小蓟中的绿原酸含量，但是小蓟中的提取工艺主要局限于多糖和黄酮的提取。

 采用微波辅助法从小蓟中提取绿原酸，以期研究出最佳提取工艺，为小蓟绿原酸的开发利用提供理论依据。

  1  材料与方法

  1.1材料、试剂与仪器

 小蓟：采摘于华北理工大学校园，干燥粉碎后备用。

 绿原酸标准品：购于中国药检中心(纯度>98%)；其它试剂均为国产分析纯。

 DNP-902电热鼓风干燥箱：上海精宏仪器设备有限公司；752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司：JA-2003型电子分析天平：上海上平仪器公司；WG700SL23-K6格兰仕微波炉：佛山市格兰仕电器有限公司；FA100 4B电子天平：上海越平科学仪器有限公司；SH2-95B立式多用循环水真空泵：上海予英仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

  1.2试验方法

  1.2.1绿原酸标准曲线的绘制

 精确称取绿原酸标准品2 mg，用无水乙醇溶解并定容于50 m L的容量瓶中。用移液管准确吸取0.5，1，1.5,2，2.5和3 m L上述标准溶液于6支试管中，用无水乙醇定容至10 m L，即将母液配成2，4，6，8，10和12 μg/m L标准溶液，然后用紫外可见分光光度计在327 nm波长处测量吸光度。最后以样品的浓度C(μg／m L)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合回归方程。

  1.2.2样品绿原酸含量的测定

 样品绿原酸含量的测定：绿原酸经提取后，采用95%乙醇沉淀，离心得到上清，取适量稀释，定容后于327 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中绿原酸的得率。

1.2.3单因素试验设计

 以绿原酸得率为指标，准确称取小蓟粉末1.000 0g．选取粒度、液料比、微波功率和提取时间作为影响小蓟绿原酸得率的单因素，每个因素选取5个水平，每组试验重复3次，取其平均值。

1.2.4工艺优化试验设计

 在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计原理，利用响应面分析方法对小蓟绿原酸提取工艺进行优化。

2结果与讨论

2.1绿原酸标准曲线的绘制

标准曲线如图1所示。

2.2单因素试验结果

2.2.1粒度对小蓟绿原酸得率的影响

 准确称取小蓟粉末1.000 g，在液料比为25：1( m L/g)，微波功率400 W，微波时间为90 s条件下，分别研究40，60，80，100和120目大小对小蓟绿原酸得率的影响。结果如图2所示，小蓟粉末粒度为80目时，绿原酸的得率最高，但随着粒度的进一步减小，绿原酸的得率反而下降。这说明小蓟粉末的颗粒越小，里面的物质溶出越多，使得溶液的黏度越大，影响传质，因而不利于绿原酸的提取。因此选择最佳粒度为80目。

2.2.2液料比对小蓟绿原酸得率的影响 

准确称取小蓟粉末1.000 g，在粒度为80目，微波功率400 W，微波时间为90 s条件下，分别研究液料比为10：1.15：1，20：1，25：1和30：1（m L/g）对小蓟绿原酸得率的影响。结果如图3所示，当液料比为25：1（m L/g）时，绿原酸得率达到峰值，当液料比增至30：1(m L/g)时，绿原酸得率略有下降，这说明一定范围内萃取剂的量越大越有利于绿原酸的萃取，当液料比达到一定值时，绿原酸的溶出量已经达到最大限度，此时液料比继续增大，对提高绿原酸得率意义不大。况且过大的液料比造成资源的浪费，增加后续处理的困难。因此选择液料比为25：1(m L／ g)。

2.2.3微波功率对小蓟绿原酸得率的影响

  准确称取小蓟粉末1.000 g，在粒度为80目，液料比为25：1(m L/g)，微波时间为90 s条件下，分别研究微波功率为100，250，400，550和700 W对小蓟绿原酸得率的影响。结果如图4所示。微波功率从100W增大到550 W的过程中，绿原酸得率迅速提高，这可能是由于微波功率在一定范围内时，随着微波功率的增大，体系吸收的能量增加，分子运动加剧，有利于物质的溶出，使得绿原酸得率提高；但微波功率过大时，会引起体系局部高温，不稳定的绿原酸的邻二酚羟基结构易被氧化分解，从而使得率下降。因此选择550 W为最佳微波功率。

2.2.4提取时间对小蓟绿原酸得率的影响

  准确称取小蓟粉末1.000 g，在粒度为80目，液料比为25：1(m L/g)，微波功率550 W条件下，分别研究30，60，90，120和150 s对小蓟绿原酸得率的影响。

  结果如图5所示，微波提取时间从30 s增大到90 s的过程中，绿原酸得率迅速增大，这可能是由于随着时间的延长，微波辐射更充分，使得绿原酸得率增大；但微波作用过长时，会引起体系温度过高，造成绿原酸的分解，从而使得率下降。因此选择90 s为最佳微波提取时间。

2.3响应面法优化

  依据Box-Be hnken试验设计方案，在单因素试验的基础上，以液料比、微波功率和提取时间为自变量，以绿原酸的得率为响应值，采用三因素三水平响应面分析法来优化绿原酸的最佳提取工艺。试验设计及结果见表1。

 用Design-Expert 8.0.6.1软件对表1的数据进行处理，其方差分析结果见表2，并对响应值与各个因素进行回归拟合，其拟合方程为：

 由表2的方差分析可知，模型的p<0.01，差异极显著，失拟项p=0.054 2，为不显著，R2=0.988 9．R2adj=0.934 0，以上参数说明回归模型拟合程度较好，试验误差小，可以用该模型对微波辅助提取小蓟绿原酸的得率进行分析和预测。

从F值可知，各因素对小蓟绿原酸得率的影响顺序为：C>B>A，即提取时间>微波功率>液料比，一次项B和C为极显著，交互项BC表现为极显著，AB. AC表现为不显著，二次项A2、B2和C2极显著，说明二次项响应值对试验结果影响很大，不是简单的一次线性关系。两因素交互作用对绿原酸得率的影响如图6所示。

 由图6可知，响应面开口向下，表明在一定范围类，随着各个因素的增大，响应值增大；当达到最大响应值后，随着每个因素的增大，响应值逐渐减小。相比较而言，B与C响应面较陡，A与B次之，A与C比较平缓。交互作用响应面图显示，B与C的交互作用对绿原酸提取率有极显著的影响，而A与B、A与C的交互作用对绿原酸提取率无显著影响。

2.4验证试验

 利用Design Expert 8.0.6.1软件进行工艺参数的优化组合，可得小蓟绿原酸提取的最佳工艺条件为液料比26：1(m L/g)，微波功率519.90 W，提取时间95.58s，在该条件下小蓟绿原酸得率预测值为2.79%。考虑实际操作的可行性，将上述最佳条件修正为液料比为26：1(m L/g)，微波功率550 W，提取时间95s，经过3次重复试验，得到小蓟绿原酸得率的平均值为2.81%，与预测值接近。

3结论

 在单因素试验的基础上，利用响应面法对微波辅助提取小蓟绿原酸的工艺条件进行了优化，并建立了合理可靠的二次多项模型。在液料比为26：1(m L/g)，微波功率550 w，提取时间95 s的条件下，小蓟绿原酸得率达到2.81%。该研究为绿原酸的工业化生产提供有效的理论依据，为中药材资源的进一步开发利用起到积极的促进作用。