乳酸菌发酵花粉活菌制剂的冻干保护研究

 刘国1，李海龙2，边军英1

1．浙江亚林生物科技股份有限公司（杭州311400）；2．中国林业科学研究院松花粉研究开发中心（杭州311400）

摘要研究乳酸菌发酵花粉产物进行冷冻干燥时的保护策略。通过单一保护剂筛选和正交试验设计，得到最佳的复合保护剂：乳清蛋白粉50、海藻糖6%、木糖醇1%。环境温度胁迫处理的影响研究表明，冷胁迫和热胁迫可提高乳酸茵的冻干存活率。优化后的综合保护工艺为：发酵结束后，加入上述复合保护剂，升温至45℃热处理30 min，然后降温至8℃冷处理90 min，真空冷冻干燥后乳酸茵存活率达到94.7%。冻干品在4℃下贮存60 d，存活率为81%。

关键词  乳酸菌；冷冻干燥；保护：存活率

  花粉以其丰富的营养元素和广泛的药用价值受到人们的重视，并得到广泛的开发利用。蜂花粉具有抗衰老作用、降血脂、抗前列腺增生、提高免疫力、抗辐射、抗癌、促进生长发育、对心血管系统具有保护作用等一系列有益功效。经卫生部和国家卫生计生委（现国家卫生和计划生育委员会）批准可用于食品的花粉有油菜花粉、玉米花粉和向日葵花粉等8种之多。

  但蜂花粉一般有着自身的不良腥味，食之口感苦涩，为许多人所不能接受。用乳酸菌发酵花粉，是解决花粉口感不佳的途径之一。目前，发酵花粉的研究多集中在固态发酵和花粉饮料的制备方面。固态发酵中益生菌增殖有限，处理效果不理想，并且难以实现纯培养条件和规模化生产。花粉液体饮料存在运输费用高、货架期短和需求人群难以大量服用的缺点。乳酸菌发酵花粉固态活菌制剂可弥补上述的不足，冷冻干燥因其较好的细胞生存率成为该类产品的干燥首选方法。

  目前的冻干保护研究以乳酸菌发酵剂的干燥保护为主，同时兼顾食品风味品质和乳酸菌存活量的报道则较为鲜见。发酵花粉的干燥以活菌高存活率为目标，同时需考虑花粉的主体地位，添加物不能对花粉的比例产生过大的稀释。其冻干过程与只关注活菌数的冻干菌粉发酵剂和其他非微生态食品原材料的冻干都有所不同。试验对乳酸菌发酵花粉的冷冻干燥保护策略进行研究和探讨，以期对益生菌发酵处理食品原料的活菌型制剂开发有所帮助。

1  材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料

 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）：河北一然生物科技有限公司；蜂花粉：河南省长葛市睿蜂坊蜂业有限公司；其它材料为分析纯或市售食品级。

1.1.2设备

LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1C超净工作台：苏州净化；恒温恒湿培养箱：上海精宏实验设备有限公司；通用发酵罐：镇江东方生物工程设备技术有限责任公司；VFD-2000型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1工艺流程

 灭菌花粉→发酵基质→发酵成发酵液→加入保护剂→胁迫处理→冻干成冻干品→活菌计数

1.2.2真空冷冻干燥

 将待干燥悬液倒人盘中，铺成薄层，-30℃预冻，充分冻结后，真空冷冻干燥36 h，得到冻干样品，干燥后期控制搁板温度不高于30℃。

1.2.3乳酸菌活菌数的测定方法及存活率计算

 取1 m L待测发酵液或粉末悬浮液，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选择适当的稀释度，吸取0.1m L滴于MRS平板培养基，涂布均匀，每稀释度至少做3个平行。置培养箱37℃培养48 h，对菌落进行计数，取平均值。

  按公式(1)计算原样品活菌总数。

2结果与分析

2.1单一保护剂的对存活率的影响

 冷冻干燥会对细胞造成一定的生理损伤，使细胞存活率下降，主要表现为冻结过程中冰晶的机械损伤、引起的溶质损伤、冷冻干燥前后细胞膜的结构、功能及成分的变化、关键酶失活、DNA结构的变化等。向样品中加入冻干保护剂可有效降低冻干过程中对细胞造成的损伤。常用的保护剂有糖类、多元醇类、氨基酸类、聚合物、盐类和甲胺等。

 选取脱脂乳、乳清粉、乳清蛋白粉、蔗糖、海藻糖、木糖醇、甘油和谷氨酸等作为保护剂，分别以4%的添加量考察对乳酸菌的冻干保护效果，结果见图1。

 所考察的保护剂对冻干过程中乳酸菌均有一定的保护作用。其中脱脂乳、乳清蛋白粉、蔗糖、海藻糖和木糖醇效果较好，细胞存活率在30%以上。考虑到脱脂乳对产品自有风味影响较大，蔗糖甜度较高，试验选择乳清蛋白粉、海藻糖、木糖醇进行进一步研究。

 在试验中发现，加入木糖醇的试验组冻干成品花粉块结构致密、质地较硬，冻干所需的时间也长于其他组。进一步的试验表明，为了避免干燥样品板结情况的发生，加入木糖醇的量不宜高于1%。

 对乳清蛋白粉和海藻糖进行不同添加量的试验，结果见图2。在所选范围内，加大保护剂的添加量有利于细胞的存活。脱盐乳清粉的比例达到4%，海藻糖比例达到6%时，加大添加量，存活率的提高幅度不大。

2.2复配保护剂及配比的确定

 冷冻干燥时，乳清蛋白能在菌体外形成蛋白膜，对细胞加以保护，并可固定冻干酶类，其中的其它成分也可提高菌体的冷冻干燥存活率，并为冻干物提供轻而多孔的结构。海藻糖对细胞有很好保护作用。目前，主要有2种假说解释海藻糖保护机制：一种称为“水替代”假说，该假说认为海藻糖所含羟基基团的氢键结合到膜的磷酸基团和蛋白质极性基团，取代了结晶水，形成一层保护膜以代替失去的结构水膜；另一种称为“玻璃态”假说，认为海藻糖的重要作用是形成玻璃态结构保护层。

 木糖醇具有较多的羟基官能团，能产生“优先水化作用”以及改变体系的玻璃态转变温度等，故可发挥较好的细胞保护作用。研究表明，玻璃态的糖醇可以阻止冷冻干燥及随后的贮藏过程中乳酸脱氢酶活性的丧失，并可以保护牛血清白蛋白免于冻干造成的次级结构的改变。与还原性和非还原性二糖相比，玻璃态糖醇能表现出更低的美拉德反应敏感性，故是理想的冻干保护剂之一。

  基于单一保护剂的试验结果，试验建立3因素3水平的正交试验L9(33)确定乳清蛋白粉、海藻糖和木糖醇3种保护剂的最佳复合配方，正交设计表及试验结果见表1和2。

 结果表明，在试验范围内，影响发酵花粉中益生菌冻干后存活率的因素主次顺序为：海藻糖>乳清蛋白粉>木糖醇。所得到的最佳复配保护剂组合为：乳清蛋白粉5%、海藻糖6%、木糖醇1%，其保护作用下发酵花粉冻干品中乳酸菌的存活率可达84.1%。

2.3环境胁迫对存活率的影响

 已有的研究发现，一定的环境胁迫条件可以提高微生物的干燥存活率。温度胁迫是众多胁迫中最常见的，温度胁迫分为冷胁迫和热胁迫两种。Java等通过热胁迫和渗透压胁迫提高了鼠李糖乳酸杆菌HNO01的冻干活性。Ziadi等通过热胁迫处理提高了乳酸乳球菌的冷冻干燥活力。陆英对干酪乳杆菌DB-II进行了热胁迫处理，通过50℃、45 min的处理其活力提高

了2.11倍。李宝坤的研究表明冷胁迫和热胁迫对罗伊氏乳酸杆菌CICC6226的冷冻干燥存活率都有一定程度提高，并揭示其作用机制可能是提高了细胞膜的流动性和完整性。

  试验对乳酸菌的花粉发酵物进行冷处理和热处理，考察环境温度胁迫对所含两种乳酸菌的冷冻干燥存活率的影响，结果分别见图3和图4。

 结果表明，适当的冷胁迫和热胁迫对花粉中乳酸菌的存活率有正面作用。其中冷胁迫以8℃处理90min较好，存活率提高了5%。热胁迫以45℃处理30min较好，存活率提高了6.1%。热处理温度达到50℃已对细胞产生了损伤，存活率下降。

  有研究表明，冷胁迫和热胁迫之间可能存在着交叉保护的机制，Spano等对植物乳杆菌进行胁迫处理发现，冷处理也会诱导热胁迫相关基因的表达。为了获得更强的应激效果，试验对冷胁迫和热胁迫手段依次应用的联合胁迫进行考察。试验结果表明，“冷一热”处理使存活率略有降低，而“热一冷”处理，存活率相对于未经胁迫组提高了10.6%，达到94.7%。  “冷一热”的处理方式，由培养结束时的37℃降至8℃，后又升至45℃的大温差冷热交替，可能造成了部分细胞的死亡或损伤，导致存活率下降。“热一冷”的处理方式环境温度变化相对温和，未对细胞造成不可修复的损伤，其中的热胁迫处理与赵建新等进行的42℃预培养40 min的方法有着异曲同工的作用。李宝坤通过检测LDH和ATP酶的活力，证实了预培养可提高冻干后细胞膜的完整性，有利于细胞膜流动性和通透性的维持。

2.4贮存温度对存活率的影响

对活菌型制剂而言，贮存期内的活菌存活率至关重要。贮藏条件中的温度、湿度和光照等众多因素都会对细胞的存活产生影响，而温度则是其中最为关键的因素之一。试验对食品日常存贮较为常见的室温和冷藏条件下的发酵花粉中乳酸菌存活率进行考察。室温组为样品密封包装后放置于室内（试验季节下室温约15℃～25℃），冷藏组为4 ℃冰箱冷藏，每10 d进行活菌数检测，计算存活率，结果见图5。冷藏条件下贮存2个月后，乳酸菌的存活率仍有80%以上，而室温下样品下降到34%。

3结论与展望

 通过对冻干保护剂的筛选，结合乳酸菌发酵花粉对风味的要求，得到较优的保护剂为乳清蛋白粉、海藻糖和木糖醇。正交优化试验表明，最佳的复合保护剂为乳清蛋白粉5%、海藻糖6%、木糖醇1%。花粉发酵结束后，加入复合保护剂，先进行45℃热胁迫应激处理30 min，再降温至8℃冷胁迫处理90 min，然后进行冷冻干燥，冻干品中植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的存活率达到95%左右。在室温和4℃冷藏条件下，冻干品存贮60 d后的乳酸菌存活率分别为34%和81%，有着较好的存贮稳定性。

 益生菌对人体的有益作用已为人们所熟知，各种乳酸菌活菌型产品在市场上深受人们的喜爱。用益生菌处理各种食品材料，得到具有新型风味和健康功效的食品加工技术方兴未艾。该类产品以食用材料为主体，含有数量庞大的益生菌，其干燥过程除考虑获得益生菌的最高存活率外，还需兼顾食品自身的风味等因素，这对保护剂的选用和添加量有所限制。采用具有较高抗逆性的菌种、结合具体产品选择合适的保护剂、充分发挥微生物的环境胁迫应激机制等方法的综合运用是得到适宜干燥工艺的有效途径。