青梅汁抗氧化特性的研究

 张慧敏1，李远志2

 1．内蒙古农业大学职业技术学院（包头014109）；2华南农业大学（广州51 0642）

摘要探讨了青梅汁的体外抗氧化作用。采用化学模拟体系对其总抗氧化能力，清除．OH、DPPH.及O2-的能力进行测定：通过体外动物试验，研究了青梅汁对37℃孵育后H2O2诱导的脂质过氧化产物MDA的溶血的影响。结果表明，60Brix青梅汁的总抗氧化能力为362 U/m L，强于1.0 mg/m L的VC，BHA和BHT，同时对.OHO2-·及DPPH．具有较强的清除能力，且可抑制MDA的产生和红细胞溶血。说明青梅汁具有较强的抗氧化能力。

关键词  青梅汁；抗氧化特性

  青梅果实风味独特，酸度高，且具有很高的营养保健价值，除含有丰富的碳水化合物、蛋白质、氨基酸、有机酸、矿物质和维生素外，还有丰富的黄酮和多酚类等生理活性成分。青梅中的含有的硫化合物可抑制脂质过氧化物对膜结构的损伤，具有保护肝脏的作用。这些物质可作为还原剂、自由基清除剂等成分而终止自由基的链式反应。

 近代医学进一步证明，青梅除具有抗菌、防止便秘、提高食欲、止泻等功效外，同时对高血压、心血管病等也有一定的疗效，还有防癌、治癌的功效。

 国内外大量的研究报道已证实许多植物及其提取物具有较强的清除人体内氧自由基，延缓衰老的作用。试验拟通过化学模拟和体外动物试验两种体系对青梅汁体外抗氧化作用进行初步研究，以期通过研究促进青梅消费，并为青梅保健食品的开发提供理论依据。

1  材料与方法

1.1材料

 青梅：试验所用青梅原料来自广东从化，收获季节采收，果实成熟度为八成熟。

 动物：昆明种小白鼠，雄性，体重20+2 g，由广东省试验动物中心提供。

 试剂：1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）购自Sigma公司；总抗氧化能力( TAC)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；DPPH，日本东京化成株式会社；丁基羟基茴香醚( BHA)，二丁基羟基甲苯( BHT)等试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

 UV-1700型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；H.S.G.-IIB4电热恒温水浴锅：上海仪表（集团）供销公司；Himac CR21G高速冷冻离心机：日本日立公司；FA1104型电子天平：上海天平仪器厂。

1.3试验原理与方法

1.3.1青梅汁的制备

 青梅→选果→清洗→热烫→打浆去核→酶处理→灭酶→离心( 3 000 r/min) →超滤→备用

1.3.2青梅汁总抗氧化能力(TAC)测定

 11测定原理：抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，Fe2+和邻二氮菲结合物质形成稳固的络合物，通过比色测定络合物Fe2+-邻二氮菲含量变化，可了解溶液的氧化还原状态，从而推知体系的总抗氧化能力。

 2)测定方法：按南京建成生物工程研究所TAC测{定试剂盒说明书。 

 总抗氧化能力的定义为：37℃时，每分钟每毫升液体使反应体系的吸光度( OD)每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位(U)。总抗氧化能力表示为U/m L，取样及测定重复均为3次。

1.3.3清除．OH能力的测定

  1)测定原理：Fenton反应是生物体内产生．OH的主要反应，其反应式可表示为Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH，用比色法测定Fenton反应体系产生的．OH，其中邻菲罗啉_Fe2+是该反应中的一种常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐的反映溶液氧化还原状态的改变，如果向反应中加入．OH的清除剂，则．OH减少，同时Fe2+增多，溶液颜色变红，由此可

推算．OH的清除剂对．OH的清除效率。

  2)测定方法：采用H202/邻二氮菲-Fe2+分光光度法，400 m mol/L，pH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)，

2.5 m mol/L的邻菲罗啉水溶液，2.5 m mol/L的硫酸亚铁( FeSO4)水溶液，20 m mol/L的H2O2水溶液，按表1加样，反应在37℃恒温水浴中进行，1.5 h后测定536 nm处的吸光度（A）。按式(2)计算样品对．OH的清除率。

1.3.4清除O2-·能力的测定

  采用邻苯三酚自氧化法，pH 8.2的100 m mol/LTris-HCl缓冲液含2 m mol/L的EDTA，3 m mol/L邻苯三酚溶液用10 m mol/L HC1配制，按表2加样，迅速摇匀倒入比色杯中，在320 nm下，每隔30 s测一次吸光度。反应时间为4 min，滞后30 s。计算每分钟吸光度的增值（AA/min），空白对照管的结果为邻苯三酚的自氧化速率。对照的自氧化速率需控制在0.06 0D/min～0.08 0D/min。清除率按式(3)计算。

1.3.5清除DPPH．能力的测定

 采用Fenglin的检测方法改进后进行，DPPH．乙醇溶液浓度为2.0×10-4 m mol/L，按表3加样，反应30 min后，用分光光度计在517 nm处测定各吸光度（A），蒸馏水调零，清除率按式(4)计算：

1.3.6 H2O2诱导的MDA含量的测定

 1)肝组织匀浆的制备：小鼠颈椎脱臼致死，迅速分离出肝组织，用冷的生理盐水洗净后称重，冰浴下匀浆，制成10%的悬浮液，3 000 r/min 4℃离心后取上清液分装，4℃保存备用。

 2)取肝匀浆上清液1.2 m L，分别加入6 0Brix青梅汁与1 mg/m L VC，BHA和BHT，阴性对照和阳性对照均以0.2 m L的0.05 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液代替，37℃水浴孵育15 min后，除了阴性对照加0.2 m L上述磷酸盐缓冲液外，其余各组均加入0.2 m L 50 m mol/

L H2O2，在37℃水浴孵育45 min，冰浴10 min终止反应，然后4℃3 000 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书测定MDA含量。

31 MDA含量计算公式：

1.3.7 H2O2诱导红细胞氧化溶血的测定

 1)红细胞悬浮液的制备：小鼠眼眶取血，肝素抗凝，4 0C 3 000 r/min离心得红细胞，冷生理盐水洗3次，制成0.5%悬浮液。

 2)分别取红细胞悬液0.4 m L，加入60Brix青梅汁与l mg/m L VC，BHA和BHT（以0.2 m L 0.05 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液作为阳性对照组），然后再加入0.2 m L的50 m mol/L H202启动反应，37 0C作用1h，生理盐水稀释5倍，3 000 r/min离心10 min，取上清液测A415nm，按式(6)和(7)计算溶血度和抑制率。

1.4数据分析

  测定结果以平均数（n=3）±标准误表示，采用DPS v2.00专业版统计软件，用单因素方差分析( ANOVA)进行多组之间均数的差异性检验。

2结果与分析

2.1青梅汁总抗氧化能力测定

 采用试剂盒法测定青梅汁(60Brix)总抗氧化能力，并与1.0 mg/m L的VC，BHA和BHT进行比较，结果见图1。从图1可以看出，总抗氧化能力大小为：青梅汁>VC>BHA>BHT。说明青梅汁具有较强的抗氧化能力。

2.2青梅汁对．OH的清除能力

 羟自由基(．OH)是已知的最活泼的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基。它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，且反应的速度极快，被破坏的分子遍及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等。青梅汁对fenton反应产生的．OH的清除效果如图2F示。图2表明，60Brix青梅汁清除．OH的能力强于1.0 mg/m L VC,  1.0 mg/m L BHA和1.0 mg/m L BHT。

2.3青梅汁对O2-·的清除能力

 O2-·是所有氧自由基中的第一个自由基，可以经过一系列反应生成其他氧自由基，与许多疾病有密切的联系，因此测定青梅汁对O2-·的清除作用具有重要的意义。

 邻苯三酚在碱性条件下能够迅速自氧化，释放O2-.，加入清除剂后能够清除其中的O2 ．，从而使邻苯三酚的自氧化速率降低。6 0Brix青梅汁与VC清除清除O2-·能力的比较见图3。由图3可以看出，6 0Brix青梅汁对邻苯三酚自氧化产生的O2-·具有一定的清除作用，1.0 mg/m L VC清除能力最强。试验中测定1.0mg/m L BHT和BHA对邻苯三酚自氧化产生的O2-·清除能力，由于浓度太小，不能对O2-·得到有效的清除。

2.4不同浓度青梅汁对DPPH．的清除能力

 DPPH．是一种稳定的自由基，其孤对电子在517nm附近有较强吸收。当有清除剂存在时，吸收消失或减弱，测定吸收减弱的程度可以评价自由基清除剂的活性。不同浓度的青梅汁清除DPPH．的能力见图4。

 从图4可知，青梅汁(60Brix)对清除DPPH．的能力随着浓度升高而增强。将6 0Brix青梅汁稀释后，其清除DPPH．的能力降低，但当稀释倍数在10倍以下时，其清除DPPH．的能力下降幅度不大，稀释10倍时，DPPH．的清除率从6 0Brix青梅汁的100%降到82.32%：但当稀释倍数进一步增大时，其DPPH.的清除率则急剧下降，稀释30倍时为41.42%，下降了

2.4倍。

2.5青梅汁与其它抗氧化剂清除DPPH．能力的比较

 VC, BHA和BHT是常用的抗氧化剂，且在食品领域已经得到了广泛的应用。因此，试验对这三种抗氧化剂对DPPH．的清除能力进行了测定，结果如表4所示。

 从图4和表4结果可以看出，60Brix青梅汁稀释2倍的清除DPPH．能力接近于浓度为0.20 mg/m L抗坏血酸溶液，60Brix青梅汁稀释10倍的清除DPPH．能力和0.15 mg/m L BHA溶液和0.10 mg/ml抗坏血酸溶液相当，由此说明青梅汁具有很强的清除DPPH．能力。

2.6青梅汁对H2O2诱导的脂质过氧化产物MDA生成的影响

  表5结果表明，阳性对照组MDA的含量明显高于阴性对照组。加入青梅汁，MDA生成量显著减少，说明青梅汁可抑制生物体的脂质过氧化反应，进而减少终产物丙二醛( MDA)的生成，且抑制作用随浓度的增大而增强。

2.7青梅汁对H2O2诱导红细胞氧化溶血的抑制作用

  表6的数据表明，不同浓度的青梅汁对H2O2诱导的红细胞氧化溶血均有显著的抑制作用，表明青梅汁可抑制生物体的氧化损伤，保护红细胞膜，且抑制作用随浓度的增大而增强。

3讨论

  现已证明与自由基有关的疾病有上百种，其中包括对人类威胁最大的心脑血管病和肿瘤，诸如老年痴呆、糖尿病、肺气肿、白内障及各种炎症，甚至令人闻之变色的艾滋病都有自由基介导和参与的确切证据。

  生物体内常见的自由基有：超氧阴离子自由基（O2-），羟基自由基(．OH)，烷氧基自由基

(RO．)等。O2-·形成最早，．OH作用最强，ROOH链锁反应循环最持久，一旦清除了O2-．，  . OH的形成即中断，则可从根本上预防体内形成过多的．OH和其他活性氧自由基，达到防癌、抗癌、抗心血管等疾病的目的。

 机体过量的自由基可以引发生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，产生MDA和过氧化脂质，它们的含量变化可定量反映生物膜的受损程度。膜的完整性受损，从而使膜的通透性增加，引起膜内外物质的外泄和内流，造成如红细胞溶血现象的发生。通过动物试验证明，青梅汁具有防止膜脂质过氧化的作用，显著降低肝匀浆的自氧化与H2O2诱导氧化所产生的MDA以及红细胞氧化溶血。

 结合化学体系试验结果，可充分说明，青梅汁具有较强的抗氧化作用，保护膜系统免受损伤。这对促进青梅消费，并为青梅保健食品的开发提供理论依据。

 但由于试验仅是体外试验，而生物体内的氧化代谢是极其复杂的，因此，有待于进一步的研究青梅汁的抗氧化作用。

4结论

 通过化学模拟和体外动物试验两种体系对青梅汁体外抗氧化作用进行初步研究，证明青梅汁具有较强的抗氧化能力。主要结论如下：

 1)采用试剂盒法测定青梅汁(60Brix)总抗氧化能力强于1.0 mg/m L的VC，BHA和BHT。

 2)青梅汁(6 0Brix)对Fenton反应产生的．OH的清除能力强于1.0 mg/m L VC，BHA和BHT。

 3)青梅汁(60Brix)对邻苯三酚自氧化产生的O2-·具有一定的清除作用，VC清除能力最强。

 4)青梅汁(6 0Brix)对清除DPPH．的能力随着浓度升高而增强，青梅汁(6 0Brix)稀释2倍的清除DPPH．能力接近于浓度为0.20 mg/ml抗坏血酸溶液，青梅汁(6 0Brix)稀释10倍的清除DPPH．能力和0.15mg/m L BHA溶液和0.10 mg/m L抗坏血酸溶液相当，由此说明青梅汁具有很强的清除DPPH．能力。

  5)青梅汁可抑制生物体的脂质过氧化反应，进而减少终产物丙二醛( MDA)的生成，且抑制作用随浓度的增大而增强。

 6)不同浓度的青梅汁对H2O2诱导的红细胞氧化溶血均有显著的抑制作用，表明青梅汁可抑制生物体的氧化损伤，保护红细胞膜，且抑制作用随浓度的增大而增强。