响应曲面法优化光合细菌PB-Z的产氢条件

 张乐，  吕永康，  刘玉香，  孙明星

（1．太原理工大学化学化工学院；

2．太原理工大学煤科学与技术教育部和山西省重点实验室；

3．太原理工大学环境科学与工程学院，山西太原030024）

 摘要：为探究光合细菌PB-Z产氢的最适产氢条件，在单因素实验的基础上，以镁离子浓度、pH、反应时间为实验因素，以光合细菌PB-Z产氢量为响应值，采用响应面分析法对实验结果进行模拟及分析，建立了产氢量与3个自变量关系的二次多项式数学模型。结果表明，镁离子浓度、pH值、反应时间与产氢量存在显著的相关性。确定光合细菌PB-Z的最佳产氢条件为：镁离子浓度4.77 mmol/L，初始pH 7.05，反应时间77.5 h。在此实验条件下，产氢量为689.3 mL/L-培养基，与预测值相比偏差仅4.8%。说明响应曲面法优化光合细菌PB-Z的产氢条件是可行的。

 关键词：光合细菌；镁离子；pH；反应时间；  响应曲面法

 光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一类能以光合作用产能的水生微生物的总称，其广泛存在于自然界中，在海洋、河湖、富含有机质的污泥中均有分布。光合细菌应用广泛，在食品、废水处理、农业、水产养殖、医药卫生等领域均发挥着重大作用。光合细菌可利用体内的光合结构在利用有机物（有机废水）的同时转化光能为氢能，氢气具有热值高，燃烧产物清洁无污染等特点，被认为是21世纪最具应用价值的可再生能源之一。目前，对光合细菌产氢条件优化的研究有很多，主要有光强、温度、碳源氮源种类及浓度、pH等，但是镁离子浓度、pH、反应时间对光合细菌产氢的影响及其相互作用的研究却很少见，这些条件对光合细菌产氢起着重要的作用，具有很重要的现实意义。镁离子是光合细菌体内大量存在的元素之一，Lilit Hakobyan等认为，很多种光合色素例如细菌叶绿素( Bchl)都含有镁离子，此外，镁离子还是光合细菌细胞内许多酶的活化剂，其对光合细菌产氢有着重要影响。本文利用从污水处理厂二沉池活性污泥中分离纯化出来的光合细菌PB -Z为菌种，前期实验发现，镁离子浓度对该光合细菌PB-Z的产氢具有很大影响，因此，优化光合细菌PB-Z的产氢条件为其进一步的开发应用奠定理论基础，为提高光合细菌产氢量及其后续的应用研究创造条件。

1  材料与方法

1.1  实验材料

  试验用菌种：本文采用的高效产氢光合细菌菌种PB-Z是从太原河西北污水厂的二沉池活性污泥样品中，进行菌种的富集、分离、纯化后，筛选出的产氢效率相对较高的紫色非硫光合细菌，经16S rDNA测序及同源性比较，鉴定为沼泽红假单胞菌，菌液颜色为深红色并有少量红色沉淀，菌种活性良好。

 生长培养基：CH.3COONa - 3H20 3 g，NH4C1 0.5 g，MgCl2 -6H20 0.2 g,Na2HP04 -12H20 0.5 g,NaCl 2 g,蛋白胨lg，酵母膏0.2 g，微量元素溶液(g/L，MnS04．4H20 2.1,H.3BO:+ 2.8,ZnS04 - 7H20 0.248,FeS04 - 7H201.8，(NH4)6M07024-4H20 8)l mL。蒸馏水1 000 mL，pH=7。

 产氢培养基：C6H1206 12.6 g，CH4N20 0.6 g，MgCl2-6H20 0.2 g,NaCl l g,K2HP04·3H20 0.5 g，酵母膏0.2 g，微量元素溶液(g/L，MnS04·4H20 2.1，H3BO。2.8,ZnS04 - 7H20 0.248,FeS04 - 7H20  1.8, (NH4)6M07024.4H20 8)l mL。蒸馏水1 000 mL，pH=7。

1.2  实验方法

1.2.1  实验装置

  本文实验装置如图1，培养容器采用250 mL玻璃瓶，加入200 mL培养基，接种在生长培养基中培养72 h的种子液，接种量为20%。氢气的收集采用排水集气法，定时记录产氢量。使用100 W的白炽灯作为光源，培养条件为温度(30±2)℃，光强4 500 lux。

1.2.2  产氢条件研究

1.2.2.1  单因素实验

 在200 mL液体产氢培养基中接种光合细菌菌液40 mL，使接种后菌液的OD660为(0.32+0.006)。设置pH为6、7、8、9，来分析其最适产氢pH值；在pH为7条件下，设置培养基镁离子浓度为1、3、5、7 mmol/L，分析其最适镁离子浓度与产氢量及产氢速率随时间的变化规律。

1.2.2.2  响应曲面实验设计

选择镁离子浓度、pH、反应时间3个因素作为响应变量，以光合细菌的产氢量为响应值，通过响应曲面法分析进行产氢条件的优化，得到最优产氢条件。各实验组的编码与取值见表1，根据单因素实验结果，最佳镁离子浓度为5 mmol/L，故选择镁离子浓度为3、5、7 mmol/L;最佳pH为7，故选取pH值为6、7、8；产氢反应在36 h时有最大的产氢速率，84 h后产氢量增长幅度很小，反应时间过短则反应不能充分进行，过长则造成设备的浪费和效率的降低，综合考虑，选取反应时间为36、60、84 h。

1.2.3  分析检测方法

 菌密度的测定：采用分光光度计（SP-752，上海光谱）测定菌液在660 nm波长下的菌密度（OD660）。

 菌液pH的测定：采用Sartorius PB-10型酸度计。

 氢气含量的测定：采用上海海欣色谱有限公司的GC-950型气相色谱，色谱柱为TDX-01，载气为氩气。氢气的测定采用外标法，进样口温度和检测器温度分别为120、150℃。

2  结果与分析

2.1  单因素实验结果

2.1.1pH对产氢量的影响

  从图2中可知，在pH为7时，光合细菌PB-Z累积产氢量达到最大，第108小时达到(641.7+13.5) mLH2/L-培养基，酸性条件和碱性条件均会影响光合细菌PB-Z的产氢量。这是由于酸性条件和碱性条件会影响光合细菌产氢相关酶的活性，使其活性降低，导致产氢量下降。

2 .1.2  镁离子浓度与反应时间对产氢量及产氢速率的影响

由图3、4看出，镁离子浓度从1 mmol/L增加到5 mmol/L过程中，随着镁离子浓度的增大，产氢量也随之增加，当镁离子浓度为5 mmol/L时，反应器的累积产氢量达到最大，为(733.4+12.7) mL H2/L-培养基，当镁离子浓度增大到7 mmol/L时，产氢量随之减少（图3）。Liu等和Lilit Hakobyan等认为，镁离子参与了光合细菌许多色素和酶的合成，光合细菌产氢与光合色素和产氢相关酶有着重要的关系。一定浓度的镁离子会促进产氢相关酶活性的提高和光合色素的合成，近而使光合细菌的产氢量得到提高。由图4，当镁离子浓度为1—5 mmol/L时，光合细菌PB-Z在培养至36 h时得到最大产氢速率。但是当镁离子浓度为7 mmol/L时，光合细菌PB-Z的最大产氢速率出现在第48小时。表明不同浓度的镁离子对光合细菌PB-Z产氢速率随时间变化的趋势有着一定的影响。当镁离子浓度为5 mmol/L时，得到最佳和最大产氢速率为(25.96+2.35) mL H2/(L．h)。光合细菌PB-Z具有良好的产氢性能，其产氢量与产氢速率均高于Siang Chen Wu等和Ela Eroglu等筛选的光合细菌Rhodopseudomonas palustris WP3-5和Rhodops -eudomonas sphaeroides O.U.OOl.

2.2  响应面法(RSM)分析

2.2.1  响应曲面设计实验结果分析

 利用响应面法考察各因素交互作用的影响，共17个实验点，其中13个为析因点，4个为零点。零点实验进行4次，做误差：1，结果如表2所示。对实验结果拟合，建立各个参数和相应量的二次方程式如下：

 Y =605.76 -50.8A +24.18B +132.83C +6.72AB+29.88AC_3.07BC_122.52A2_207.22B2_88.67C2

对表2中的数据进行统计分析，得到回归方程式的方差分析如表3所示。

 由表3可知，模型P=O.OO0 4<0.001，说明实验所采用的二次模型是极显著的，在统计学上是有意义的；模型中的参数A、C、A2、B2、C2也是显著的(P<0.05)。模型的适应性显著（F值为19.42，P<O.OOl），模型的失拟项不显著(P=0.092 0>0.05)，说明回归方程描述各因子与响应值之间的非线性方程关系是显著的，也就是说明这种实验方法是可靠的。模型的相关系数是0.961 5，说明该模型能解释96.15%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好。修正复相关系数平方R2础= 0.923 4，进一步说明模型具有较好的回归性。精确度是反应信号噪声比的，通常要求大于4。本模型的精确度为11.409，说明模型是精确的，在设计区间内是有效的。综上所述，说明在研究区域内该回归方程能够很好地模拟真实的曲面，模型的精密度、可信度和精确度均在可行的范围内，因此可用该回归模型对光合细菌产氢过程中的产氢量优化实验条件进行分析、预测。

2.2.2  响应曲面分析与优化

  根据回归方程，采用Design-Expert软件对该模型绘制响应曲面图，考察所拟合的响应曲面形状，图5—7所示为回归方程预测的3个因素耦合影响下的响应面三维图及相应等高线图。

 图5表明，镁离子浓度和pH对光合细菌PB-Z产氢影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。在当前实验范围内，当镁离子浓度不变，随着pH的升高，产氢量先升高后降低，当pH不变，随着镁离子浓度的升高，产氢量先升高后降低。产氢量变化速率显示．镁离子浓度的主效应强于pH效应，等高线接近圆形，说明镁离子浓度和pH的交互作用不显著。图6反映了镁离子浓度与反应时间对产氢量的交互影响，当反应时间不变时，随着镁离子浓度的升高，产氢量先升高后降低。当镁离子浓度不变时，随着反应时间的增长，产氢量变化曲线呈增长趋势并逐渐趋于平缓，产氢量变化速率显示，镁离子浓度的主效应弱于反应时间效应，等高线接近椭圆，说明镁离子浓度与反应时间交互作用显著。由图7看出，当反应时间不变时，随着pH的升高，产氢量先升高后降低。当pH不变时，随着反应时间的增长，产氢量变化曲线呈增长趋势并逐渐趋于平缓，产氢量变化速率显示，pH的主效应弱于反应时间效应，等高线接近椭圆，说明pH与反应时间交互作用显著。

 3组图直观地反映了各个因素对响应值的影响，利用Design-Expert软件进行实验结果优化，本实验主要目的在于优化光合细菌PB-Z最适产氢条件，通过分析得到优化结果为：镁离子浓度4.77 mmoUL，初始pH 7.05，反应时间77.5 h，此时光合细菌PB -Z的产氢量为657.7 ml/L-培养基。光合细菌产氢3个参数对产氢量的影响两两之间有一定的交互作用，其中初始pH值，反应时间，镁离子浓度对产氢量影响大小为：反应时间>镁离子浓度>初始pH值。

2.2.3  实验结果验证

 为检测响应曲面法所得结果的可靠性，再次进行实验，采用上述优化条件进行3次平行实验，实际测得的平均产氢量为689.3 ml/L-培养基，实验值与理论值相对误差仅为4.8%，证明应用响应曲面优化光合细菌PB-Z的产氢条件是可行的。

3  结论

 本文通过单因素试验，研究影响光合细菌PB-Z的产氢条件的3个重要因素，即镁离子浓度、pH、反应时间。利用Design-Expert软件对该模型绘制响应曲面图，建立优化光合细菌PB-Z最适产氢条件的数学模型，根据回归分析可知光合细菌PB-Z最适产氢条件是：镁离子浓度4.77 mmol/L，初始pH 7.05，反应时间77.5 h，其中初始pH值，反应时间，镁离子浓度对产氢量影响大小为：反应时间>镁离子浓度>初始pH值。为进一步研究提供了科学依据。