李紫惠， 曹刚， 邵基伦， 黄郑郑， 莫测辉，
(1．暨南大学环境学院，广东广州.5106;30;
2．广东省高校水土环境毒害性污染防治与生物修复重点实验室，广东广州510630)
摘要：异养硝化一好氧反硝化菌是一种新型生物脱氮菌，筛选出脱氮效率高的菌株并对其硝化条件进行优化具有重要意义。从实验室筛选出的异养脱氮菌XH02出发，通过生理生化及分子生物学方法对其鉴定，结果表明，高效脱氮菌株XH02与人苍I 7I朴曲Ochrobactrumanthropi的ATCC 49188序列同源性最高，初步鉴定为人苍白杆菌；利用响应面法对温度、转速、碳氮比(C/N)和初始pH值4个异养硝化影响因子进行优化，得到在10%接种量下XH02菌最佳硝化条件，即温度34℃，转速125 r/min，C/N 7.5，初始pH 7.5;该条件下，在24 h时氨氮去除率可达82.4%。通过3次平行试验验证表明，在4个环境影响因子优化后的条件下，该菌对氨氮的去除率为82.2%，与预测值相对误差为0.3%，表明模型模拟效果良好。文章对具有异养硝化好氧反硝化功能的Ochrobactrum anthropi菌用于牛物脱氮的工程实践提供参考。
关键词：异养硝化一好氧反硝化； 响应面法； 人苍白杆菌；影响因子；优化
随着工业化和城市化进程的加快，我国含氮废水进入水体引发的水质恶化及富营养化问题日益严重，对人体健康和生态环境造成潜在的威胁。目前国内外处理含氮废水的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法成本高且工艺复杂，一般只能去除水中特定形态的氮且对环境有二次污染。生物法由于其具有成本低、操作简单、无二次污染和处理效果好的特点，目前广泛应用于水体脱氮的过程中。传统生物脱氮技术中硝化和反硝化是2个相互独立的过程，且整个生物脱氮过程不能同时在同一空间进行，导致其脱氮工艺较长而且复杂。鉴于此，人们提出了一些新型生物脱氮技术，如厌氧氨氧化、短程硝化反
硝化和同步硝化反硝化等。近年来，随着越来越多的异养硝化菌和好氧反硝化菌的发现分离，传统的生物脱氮技术正在被打破，研究表明，异养硝化菌可以将氨氮直接转化为羟胺、亚硝酸盐、硝酸盐，好氧反硝化菌可以将亚硝酸盐、硝酸盐直接还原为氮气和氧化亚氮等气态产物。目前，越来越多的研究表明，有些菌能在有氧条件下完成反硝化，而且有些菌可以进行异养硝化一好氧反硝化。这也使得有关异养硝化一反硝化生物脱氮的研究逐渐成为热点。异养硝化一好氧反硝化菌的研究目前主要集中在在假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和产碱菌属（Alcaligenes）等，而对人苍白杆菌属（Ochrobactrum anthropi）的研究则鲜有报道。
目前人苍白杆菌的研究主要集中在其致病性、感染性、还原重金属能力等方面，而人苍白杆菌作为具有异养硝化一好氧反硝化能力的菌株，在脱氮方面的研究较少，因此本文对人苍白杆菌硝化条件的研究有一定的意义。
目前许多异养硝化一好氧反硝化菌的研究主要集中在实验室阶段，需要进一步研究才能有效应用于实际工程中，并且相关的机理研究还不够深入，需进一步研究。
影响异养硝化一好氧反硝化菌生长的因素很多，主要包括碳源、氮源、接种量、温度、pH值、C/N、溶解氧等，因此如何对其培养条件进行优化显得非常重要。目前对异养硝化一好氧反硝化菌培养条件的优化方法主要有单因素法和正交试验法，而应用响应面法对该类菌硝化条件的优化较少。响应面法是一种寻找多因子系统中最优条件的数学统计方法，可以较精确地研究各因子之间的关系，从而获得最优方案。该方法试验次数少、周期短，能够研究几个因素间交互作用，求得的因素与响应值间的回归方程精确度高。目前，响应面法已应用于生物、食品、农业和化学等领域，如陈丽娟等采用响应面法分析法对苯酚降解影响因素进行优化。
本文从广州大坦沙污水处理厂好氧段活性污泥中筛选出一株高效脱氮的异养硝化一好氧反硝化菌，对其进行生理生化及16S rDNA鉴定，并利用响应面法从温度、初始pH值、C/N、转速共4个环境因素方面优化其硝化条件，使其达到最佳的脱氮效率，为异养硝化菌用于生物脱氮的工程实践提供参考。
1试验材料和方法
1.1 实验菌株来源
从广州大坦沙污水处理厂好氧段活性污泥中筛选分离的异养硝化一好氧反硝化菌株，编号为XH02。
1.2培养基
LB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，氯化钠5g，加水溶解，补充蒸馏水至1000 mL，pH 7.4—7.6。用于菌株活化。
异养硝化培养基：(NH4)。S0。lg，柠檬酸钠520 g，Na2HP04 0.5 g,KH2P04 0.5 g,MgS04' 7H20 0.2 g,NaCl 30 g，微量元素2.00 mL，加水溶解，补充蒸馏水至1000 mL，pH 7.0—7.5。用于菌株筛选及硝化性能的测定。
好氧反硝化培养基：KNO。lg，柠檬酸钠5.52 g，Na2HP04 2.0 g,KHzP04 1.0 g,MgS04-7Hz0 0.1 g，微量元素2.00 mL，加水溶解，补充蒸馏水至1 000 mL，pH 7.0～7.3。用于菌株反硝化性能的测定。
微量元素溶液：EDTA 50.0 g．ZnS04 2.2 g，CaCl2 55 g,MnCl2-4H20 5.06 g,FeSO t-7H20 5.0 g, (NH,1)C}Mo.02'4H20 1.1 g,CuSOd -5H20 1.57 g,CoCl2-6H20 1.61 g,加水溶解，补充蒸馏水至1 000 mL，pH 6.O。
灭菌条件：所有培养基经121℃，灭菌20 min。试验中根据不同C/N调节异养硝化培养基中柠檬酸钠的量使其符合试验要求。
1.3主要仪器设备
THZ-C恒温振荡器，SW-CJ-1F型单人双面净化工作台（苏州净化有限公司），LRH-250-A生化培养箱，LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器，Labnet P3960移液枪（美国莱伯特公司），YP-B10002型电子天平（上海光正医疗仪器有限公司），PHS-25 pH计，UVmini-1240紫外可见分光光度计，PCR仪。
1.4 菌株的硝化及反硝化特性的测定
将待测菌株分别按10%接种量加入到异养硝化和好氧反硝化培养基中，每隔12 h测定氨氮及硝态氮的去除率。
1.5分析方法
试验中测试指标和测定方法如下：氨氮，纳氏试剂分光光度法；硝态氮，紫外分光光度法。
1.6菌株的鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》，得到通用引物27F和1492R，采用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测菌模板DNA，对待测菌株基因组进行PCR扩增，送出测序。
1.7菌株硝化影响因子的优化
在以温度、C/N、转速和初始pH值为单一变量的实验基础上，采用响应面法对硝化的影响因子进行优化。
2结果与讨论
2.1 菌株的硝化及反硝化特性曲线
从图1可以看出，在设定温度为30℃、转速为120 r/min、接种量为10%和初始pH值为7.0的条件下，该菌氨氮及硝态氮去除率均随着培养时间的增大而增大。该菌株在24 h时氨氮及硝态氮去除率均在75%左右，继续培养氨氮及硝态氮去除率继续增大，在48 h时达到90%左右，表明该菌株的硝化及反硝化作用均较好。为了尽量控制可变因素，以后每次实验接种前菌株活化时间和培养时间均取24 h。
2.2菌株XH02的鉴定
2.2.1形态学鉴定
XH02菌的电镜扫描结果见图2，该菌呈细杆状，大小为0.5 ymx1.0 p4m。
2.2.2分子生物学鉴定
利用通用引物27F、1492R对菌株XH02的DNA进行PCR扩增，扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果提交到NCBI，经BLAST检索、比对并用MEGA 5.0构建系统发育树，结果见图3。由图3可知菌株XH02与人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi )ATCC 49188序列同源性最高，达到99%，结合菌株的形态学和生理生化特性，基
本确定菌株XH02属于人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)。
2.3菌株XH02异养硝化的单个环境因子的最佳范围确定
2.3.1最佳温度的确定
温度的大小会直接影响菌株相关酶的活性和对营养物质的吸收，适宜的温度有利于菌株在环境中生存，有利于发挥菌株最佳的脱氮能力。一般而言，异养硝化一好氧反硝化菌的最适温度在25—37℃范围内。本文选取温度分别为20、25、30、35和40℃。由图4可知，当温度较低时，氨氮去除率随温度的增加而增加；当温度为35℃附近时，氨氮去除率达到最大值；随后，随着温度的增加，氨氮去除率降低。因此，在其他条件不变的条件下，确定其最佳温度在35℃附近。
可见中温环境下该菌脱氮效果较好，温度较高或较低可能会影响菌株中酶的活性从而导致脱氮效率降低，这与姜明娇研究的高效异养硝化菌B9的最适温度35℃一致。
2.3.2最佳转速的确定
溶解氧的多少对于好氧型细菌的生存至关重要，不同的好氧型细菌因其代谢机制不同，对溶解氧的需求也不尽相同，而摇床转速的变化会影响培养基中溶解氧含量的多少，因此可通过摇床转速的改变来改变培养基中的溶解氧浓度。由图5可知，转速较低时氨氮去除率随转速的增加而增加；当转速为120 r/min附近时，氨氮去除率达到最大；之后，随着转速的增加，氨氮去除率降低。因此，确定其最佳转速在120 r/min左右。
可见异养硝化一好氧反硝化菌对溶解氧的需求是有限的，该菌对溶解氧的需求不宜太高。这与邵基伦研究的异养硝化一好氧反硝化Burkhloderia sp.YX02菌的最适宜转速为120 r/min 一致。
2.3.3最佳C/N的确定
C/N对异养硝化菌的脱氮率有显著影响，一般而言，异养硝化菌能够处理污水的C/N范围为2～10。由图6可知，氨氮去除率先随着C/N的增加而增加；当C/N在8.0附近时，氨氮去除率达到最大值；之后，随着C/N的增加，氨氮去除率降低。因此，确定其最佳C/N在8.0左右。
CfN体现培养基中碳氮含量的关系，本试验菌株的最佳C/N在8左右，处于正常范围，这与袁梦冬等研究的异养硝化一好氧反硝化菌的最佳C/N为8的结果一致。
2.3.4最佳初始pH值的确定
pH影响生长代谢过程中各种酶的活性和培养基中营养物质的离子化程度和有害物质的毒性，因此，初始pH值是影响微生物活性的重要因素。而大多数异养硝化一好氧反硝化菌的最适宜pH在6—9范围内。由图7可知，初始pH值较低时，氨氮去除率随初始pH值的增大而增加，当初始pH值在7.0附近时，氨氮去除率达到最大值，随后，随着初始pH值的增大氨氮去除率下降。因此，确定其最佳初始pH值在7.0左右。
大多数细菌在pH为中性时生长速度最快，本试验菌株的最佳pH在7左右时脱氮效率较高，pH处于正常范围内，这与邵基伦研究的异养硝化菌的最适pH为7.0的结果一致。
2.4响应面法优化XH02菌的异养硝化影响因子
2.4.1 Box-Behnken试验设计
根据初期试验结果，确定温度、转速、C/N和初始pH值的q1心点分别为35℃、120 r/min、8.0和7.0。表1是响应面优化XH02的硝化影响因子及水平，采用Design-Expert.V8软件对试验结果进行4次回归方程预测及方差分析，结果见表2。
2.4.2 四次回归拟合及方差分析
以第24小时时的氨氮去除率为响应值，采用Design Expert.V8软件对表2数据进行多元回归分析，得到回归方程式：氨氮去除率=81.89-2.10A+1.41B -1.35C +1.47D -1.60AB +1.47AC -1.88AD +1.51BC+1.89BD _12.34A2 _7.4082 _4.41C2 _3.89D2 +3.46A2B+2.22A2D _1.11AC2+0.7382C +3.75A282。式中：A为温度；B为转速；C为C/N比；D为初始pH值。
对所得模型进行方差分析可知（表2），模型P<0.000 1，说明四次回归方程极显著；失拟项P为0.135 3>0.05，差异不显著，不必引入更高次项，模型选择正确；模型R2-0.997 1，说明四次回归模型能较好地反映响应值的变化，模型预测值和响应值之间有很高的相关性。
温度、转速、C/N、初始pH值的一次和二次项即温度和转速、温度和C/N、温度和初始pH值、转速和C/N、转速和初始pH值之间的交互作用对氨氮去除率的影响达到极显著水平(P<0.01)。由于C/N和初始pH值之间即CD项对模型影响不显著，因此模型中不包含CD项。
2.4.3响应面分析及最佳异养硝化条件确定
根据该回归方程作响应面图，分析转速、温度、C/N和初始pH值对XH02菌去除氨氮的影响，图8显示了4个影响因子相互之间的响应面，每个响应面图分别代表2个独立变量之间的相互作用，而此时另外2个变量保持在中心点水平不变。由图8可知，5个响应面均为开口向下的凸形曲面，从其倒映的等高线图可以直观地看出两因素之间的交互作用，等高线的形状反映出交互作用的强弱，圆形表示两因素交互作用不显著，等高线形状越接近椭圆则表示两因素间交互作用越强。图8中的(a)、(d)、(e)的等高线呈圆形，而图8(b)、(c)值的等高线呈近似圆形，这表明，温度和转速、转速和C/N、转速和初始pH值、温度和C/N及温度和初始pH值之间基本上无交互作用。从图中还可直观地看出温度、转速、C/N和初始pH的最佳值分别在32—36℃、120～126 r/min、7.5—8.0和7.0—7.5范围内。
从图8中可知，回归方程存在稳定点，即存在极大值点使得响应值取得最大值，由回归方程可得到最佳异养硝化条件：温度34.32℃、转速123.93 r/min、C/N为7.69和初始pH值7.26，此时苍白杆菌的硝化效率最高，达到82.4%。考虑到实际操作的便利，将最佳的硝化条件修正为温度34℃、转速125 r/min、C/N7.5和初始pH值7.5。
2.5验证实验
在以上确定的最优条件下，进行3次平行实验，所得氨氮去除率分别为81.8%、82.3%、82.5%，平均氨氮去除率为82.2%。实测值与模型预测值相对误差为0.3%，说明模型模拟效果良好。
响应面法在实验条件寻优过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析，且能研究几种因素间的交互作用。与验证实验结果比较，采用响应面优化的得到的XH02菌的异养硝化条件准确可靠，具有实用价值。
3结论
本文从好氧段活性污泥中筛选出一株高效异养硝化一好氧反硝化菌株，经鉴定确定为人苍白杆菌属。
本文通过响应面法对Ochrobactrum anthropi菌的温度、转速、C/N和初始pH值共4个硝化影响因子进行优化，得到在10%接种量下Ochrobactrum anthropi菌最佳硝化条件，即温度34℃，转速l25 r/min，C/N7.5，初始pH 7.5;该条件下，Ochrobactrum anthropi菌在24 h时对氨氮的实际去除率为82.2%，与预测值相对误差为0.3%。响应面法对于优化异养硝化一好氧反硝化菌的脱氮条件具有良好的效果。
