嘧菌酯降解菌的分离及降解动力学分析

 李英东，  程轩，  肖梅，  陈军

 （上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）

  摘要：由于嘧菌酯的广泛使用和残留对环境中非靶标生物有氧化胁迫作用，所以其危害越来越引起人们的关注。该文驯化筛选出一株高效降解嘧菌酯的菌株，并探讨了其修复嘧菌酯污染的最适条件。利用嘧菌酯为唯一碳源筛选能有效降解嘧菌酯的菌株G7，对菌株进行形态生理生化特征试验及16S rRNA基因同源性分析确定该菌株的系统发育学地位。通过响应面分析法和正交试验确定菌株G7外界和液体降解最优条件。经过优化培养基和外界培养条件后得到48 h后在K：HPO。2 810 mg/L，KHZP04 781 mg/L，NI-kNO。1 000 mg/L，(NH4)2S04 821.39 mg/L，NaCl 825.16 mg/L，MgS04-7HZ0 1 000 mg/L，嘧菌酯168.86 mg/L，pH为7.25，温度37℃，摇床转速为175 r/min的条件下降解率最高为84.17%，并确定了G7菌株为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），通过降解动力学建立了降解过程的数学模型。

  关键词：嘧菌酯；  降解动力学分析；  生物降解；  响应面分析；  分子生物学鉴定

  嘧菌酯( azoxystrobin)是一种新型甲氧基丙烯酸酯（strobilurin）类杀菌剂，对由子囊菌亚门、担子菌亚门、鞭毛菌亚门和半知菌亚门等大多数真菌引起的病害如白粉病、锈病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的防治效果，现已开发成为广泛用作农作物的杀菌剂。据预测到2015年嘧菌酯全球消费量将达到近13 000 t，新增嘧菌酯的需求量为8 000 t。嘧菌酯是一种线粒体呼吸抑制剂，可通过阻断细胞色素b和cl之间电子转移抑制线粒体呼吸，破坏能量合成，从而发挥杀菌作用。随着嘧菌酯的广泛使用以及残留，它对环境影响的研究也成为近年来人们关注的热点。许静等对嘧菌酯在不同pH下在土壤和水体中的残留进行的检测显示嘧菌酯的持久残留会对环境造成严重的污染问题。Kroglund等[7J分析嘧菌酯残留量对大西洋鲑鱼的毒性表明其对鱼类尤其是其幼苗的线粒体有明显的抑制作用。CM stoffersen等研究还显示嘧菌酯对水蝇最低影响浓度仅为0.071 mg/L。韩颖楠等实验发现嘧菌酯会对斑马鱼肝脏的抗氧化防御系统产生影响，同时对斑马鱼肝脏和蚯蚓体腔细胞的DNA也有损伤作用，损伤程度随嘧菌酯的浓度和染毒时间的升高而增长。

 生物治理是水环境生态修复的主要途径，目前有关嘧菌酯生物降解的研究尚未有相关报道，本文报道一株高效嘧菌酯降解菌株的筛选，并通过响应面分析法优化菌株对嘧菌酯的降解条件，建立降解动力学菌体降解的数学模型，为缩短嘧菌酯在环境中的残留期，减少对环境中非靶标生物的毒害作用。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  农药和土壤样品来源

  嘧菌酯标样：购自阿拉丁标准试剂网，试剂CAS编号为131860-33-8；嘧菌酯：25%阿米西达一嘧菌酯悬浮剂，瑞士先正达公司生产（嘧菌酯原药20%；NNO2.0%；拉开粉3.0%；凹凸棒土2.0%；农乳1600# 4.0%；农乳500# 2.0%;吐温2.0%；黄原胶0.15%；乙二醇8.0%；水补足至100%）

 土壤样品：采自上海奉贤地区长期施用农药的耕种用土。

1.1.2  培养基

 (1)基础盐培养基：K2HP04 1.5 g/L，KH2P04 0.5g/L,NH4N03 1.0g/L, (NH4)2S04 0.5 g/L,NaCl 0.5 g/L,MgSO。．7H。0 0.5 g/L，根据实验需要添加适当的嘧菌酯标样，pH 7.0，0.1 MPa蒸汽灭菌30 min（菌种筛选纯化用）。

 (2)LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0，0.1 MPa蒸汽灭菌30 min。

 (3)市售农药降解培养基：K2HP04 1.5 g/L，KH2P040.5 g/L,NI-LN03 1.0 g/L,(NH4)2S04 0.5 g/L, NaCl 0.5g/L，MgSO。．7H20 0.5 g/L，根据实验需要添加适当的市售嘧菌酯，pH 7.0。正交、响应面及动力学分析用。

1.1.3  仪器设备

 Agilent 1260LC高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），SCQ-2500F超声波细胞粉碎机，ZHWY-2102C双层恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）等。

1.2  实验方法

1.2.1  高效降解菌的分离筛选及形态观察

 取上海市奉贤区长期受农药污染的土样10 g加入50 mL无菌水和8 mm玻璃珠数粒，漩涡振荡10min。用无菌移液管取10 mL的土壤悬液加入含有100 mg/L标准嘧菌酯的50 mL基础盐培养液中，在37℃，150 r/min的条件下培养48 h后取10 mL培养液接入50 mL无菌的新鲜基础盐培养基中（含有100mg/L嘧菌酯），再恒温培养振荡器培养48 h，同样方法连续驯化富集4次。经4次驯化富集后用漩涡振荡菌液混合均匀后用无菌水中连续稀释至10-5、10-6和10-7，并取每个梯度的稀释液涂布于经灭菌的以标准嘧菌酯为唯一碳源的基础盐培养平板上，置37℃恒温箱中培养48 h，待长出菌落后，挑取生长速度较快，菌落大且形态不一的菌落，再通过划线分离，挑选单菌落进行反复纯化，直到菌落表面颜色、质地等形态特征完全一致，并对筛得的菌株进行斜面保存。

 观察并记录在平板上长出菌落的个体形态特征和菌落特征，并对菌体进行革兰氏染色实验。将不同菌株以相同的接种量接种人以嘧菌酯农药为唯一碳源的50 mL基础盐培养液中，在37℃，150 r/min的条件下培养48 h后，取降解液在7 000 r/min，10℃的条件下离心15 min后取上清液l mL通过水相针式滤器过滤降解液加入进样瓶中，用HPLC检定培养液中嘧菌酯的残留量，计算嘧菌酯降解率，筛选出降解率最高的降解菌株。

1.2.2  嘧菌酯校正曲线的绘制

 称取嘧菌酯标准样品并制作梯度液，采用乙腈：水=5:3（体积比），流速：1.0 mL/min，柱温：室温，检测波长：255 nm，定量体积：10 p.L的方法绘制嘧菌酯校正曲线。

1.3  降解条件的优化

 对含有以市售嘧菌酯悬浮液的基本盐培养基的各组分进行优化，利用Plackett-Burman试验设计对每个因素设高、低2个水平(1，-1)，每组实验设3个平行。应用Minitab统计软件对试验结果进行各因素的显著性分析。再利用Box-Behnken试验设计对影响因子最大的3个因素的水平进行优化，每个因素设高、中、低3个水平(1，0，-1)，高效液相检测嘧菌酯残留量。在加入市售嘧菌酯农药(1，0，-1)3个不同浓度水平的以嘧菌酯为唯一碳源的培养基中以相同接人量接种G7菌培养液（l mL于LB培养基中摇瓶48 h的菌液），分别检验48 h后嘧菌酯降解率。计算得到关于降解率的回归方程并计算出理论最优培养基组分和最高降解率并对计算结果进行验证。

  以响应面分析出的最优培养基含量培养细菌，由于先进行了菌种分子生物学鉴定，根据分子生物学鉴定结果查找相应文献后确定了菌种所属的最适外界条件大致范围；由于本实验筛选所得菌株在液体生长过程中会聚集沉降，这种现象这对于通过分光光度计来测定菌体浓度有较大的影响，所以本次实验通过将菌种培养液分多次进行取样离心后称取其干重来表现菌体的生长曲线，细胞浓度=细胞干重(mg)/取样液体体积(mL)，通过正交试验分析摇床摇速、溶液pH以及温度对菌体降解嘧菌酯和生长率的影响，并计算出对降解菌降解嘧菌酯的降解速率和生长率的最适摇床转速、溶液pH、温度。

1.3.1  数据统计分析

  通过Minitab 16软件对Plackett-B urman和正交试验试验结果分析并绘制主效应图，Design -Expert8.06软件对Box-Behnken试验结果分析并绘制等值图和3D曲面图。运用SPSS软件对G7菌在不同嘧菌酯浓度下随时间变化的细胞浓度和降解率作显著性分析。

1.4  菌种分子生物学鉴定

  用试剂盒法提取筛选菌株基因组，以17F 1392R为引物对基因组进行PCR扩增，将扩增的16S rRNA纯化后由上海瑞楚生物技术有限公司直接测序。

1.5  降解动力学分析

  生物反应动力学是使用数学公式合理模拟微生物在生长过程中的菌体数量、底物浓度、产物之间的关系的一种有效方法。目前关于生物反应动力学的研究成果不断更新，其模型也已经提出很多类型，不同的模型适合的生物代谢反应与程度各也不相同，在降解动力学中常用的模型有：Eckenfelder模型、Ed-ward模型(1970)、Monod模型(1940)、Yano模型(1966)、Haldane模型(1965)、Webb模型(1963)等。由于嘧菌酯自身带有毒性，对菌体生长会有抑制和毒理作用，其中Haldane方程是较为常用的用来说明底物对微生物有抑制作用的数学模型之一。

 式中，qx为基质最大降解比速率(h'1)；S为基质质量浓度(mg/L)；k为Monod基质半饱和常数(mg/L)，k为基质抑制系数(mg/L)。

 以相同接种量将施氏假单胞菌属（Pseudomonasstutzeri）接入到5种不同浓度(75、100、125、150、175mg/L)的嘧菌酯浓度中，每隔5h离心菌体后使用高效液相检测上清液中嘧菌酯含量一次。使用Originpro对数据进行=阶拟合，计算在固定的起始菌种浓度和培养条件下对不同初始浓度So(mg/L)的嘧菌酯中的降解特性。

2  结果与讨论

2.1  嘧菌酯降解菌株的筛选及形态特征观察

经过在以嘧菌酯标准品为唯一碳源的选择培养基中连续富集逐级驯化培养，从采集地样品中分离筛选得到4株细菌，分别编号为G1、G3、G5、G7，其在LB平板上的菌落形态特征如表1所示。其中G7菌在48 h时降解率最高为73.24%。

2.2  嘧菌酯降解茵降解条件优化

  Plackett-B urman试验的数据统计分析表如表2所示；Plackett -B urman实验主效应图如图1所示；Box-Behnken试验的数据统计分析表如表3所示；Box-Behnken试验结果的曲面图如图2所示。经计算，在培养基最优条件下降解率最高为82.96%；通过5组平行验证实验显示在最优培养基条件下嘧菌酯平均降解率为83.2%，与预测值相近，最优培养液成分含量结果如图3所示。嘧菌酯降解的回归方程为：降解率=82.79 +0.66 xA+2.24 xB -0.54 xC +4.18 xAB+1.38xAC_1.08xBC_5.92xA2_11.47xB2_16.23 xC2(A为( NH4)2S04；B为NaCl;C为嘧菌酯）回归方程方差分析结果和回归方程系数显著性检验结果见表4，由表5可知，模型回归P>F的值小于0.001，可知该模型与实际值较为相符，结果可靠。

正交试验设计如表4，正交试验结果方差分析如表6所示，实验结果主效应图如图4所示。由于正交试验结果方差分析显示各项P值均小于0.05，具有可信度，因此根据主效应图所示，G7菌降解嘧菌酯的最佳外界条件如表7所示。在最优外界和最优培养基条件下经过3次平行验证得到G7菌对嘧菌酯的平均降解率为84.17%。

2.3  菌体的分子生物学鉴定及构建系统发育树

 将获得的16S rRNA基因序列登陆GenBank获得通过ncbi网站中的BLAST进行在线序列同源性比对，结果显示G7菌的序列与施氏假单胞菌属（Pseudomonas stutzeri）的多个施氏假单胞菌具有99%以上的一致性，分析后初步确定G7为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri).

2.4  G7菌株的生长曲线及农药降解曲线绘制

  在含有75、100、125 mg/L嘧菌酯浓度的以嘧菌酯为唯一碳源的培养基中以相同的接入量接入G7菌，G7菌在不同浓度的嘧菌酯溶液中的生长曲线如图5所示，由图5可见0—5 h在所有浓度中的G7菌生长缓慢处于延滞期，在5—35 h所有浓度中G7菌的菌浓度都显著增长，处于对数生长期，其中在100 mg/L的浓度中增长较为快速，在75 mg/L的浓度下增长较为缓慢，35 h后进入平稳期。通过高效液相检测绘制G7菌在不同嘧菌酯浓度下的50 h降解曲线，从图5中可得知G7菌在0—10 h中对125 mg/L的嘧菌酯降解率最高，在10～40 h时间段中对100 mg/L的嘧菌酯降解率最高，在40 h后G7菌对各个浓度的嘧菌酯降解率基本相同。不同嘧菌酯浓度下菌体细胞浓度与降解率之间的显著性分析如表8、表9、表10所示。3组显著性分析结果都有P<0.05，可见细胞浓度对嘧菌酯的降解率影响显著。从以上数据中得出嘧菌酯降解率的升高与G7菌的细胞浓度增长密切相关；由此说明G7菌能把嘧菌酯作为生长过程中所需的碳源来分解利用，但在实际情况中由于市场中的使用农药与表准样品中药物成分不一，菌体也有可能会利用市售农药中的其他碳类化合物作为有机物利用，因此在50h时嘧菌酯的降解率任然无法达到100%。

2.5  降解动力学分析

比降解率在不同浓度嘧菌酯中的变化见表11。

拟合曲线如图6所示。根据方程可计算得：q一=1.245 3，kr314.909 8，kr57.173 6。则动力学方程为：

拟合曲线分析表如表12所示。

3  结果与讨论

 本文通过实施嘧菌酯选择性压力驯化筛选出一株高效降解菌株G7，并运用响应面分析法和正交试验确定了该菌的最适降解条件。同时通过16S rRNA的方法初步鉴定了该菌为施氏假单胞菌（Pseu -domonas stutzeri），而有关该菌株对嘧菌酯降解性能尚未有文献报道。本次的研究结果为生态环境中残留嘧菌酯的生物降解提供了新方法，通过响应面和正交试验得到了各项化学成分和环境因素对降解菌降解率的影响同时为进一步研究在自然环境中各化学元素含量对降解菌降解率提供了依据，本次实验的正交和动力学分析都采用了市售嘧菌酯悬浮剂来进行试验，实验条件更加贴近真实的农业生产环境，实验有效证实了所筛菌种在真实的自然环境和渔业生产中具有一定的环境保护和降低毒害作用，但对于市售农药其他成分对菌株的影响以及菌株降解嘧菌酯的代谢途径还有待于进一步地研究。