周英杰， 潘松青， 张召基， 陈少华
（1．中山市环境保护技术中心，广东中山528402;
2．中科学院城市污染物转化重点实验室，福建厦门361021：
3．中罔科学院城市环境研究所，福建厦门361021）
摘要：对普通活性污泥进行硝化和反硝化预处理后富集Anammox菌。结果表明，硝化和反硝化预处理方式富集Anammox菌均耗时102 d。FISH技术分析表明，两者富集的微生物中均含Anammox菌。系统启动后(153—161 d)，硝化和反硝化预处理方式的总氮平均负荷分别达到0.437 g/(gVSS'd)和0.309 g/(gVSS -d)，总氮平均去除率分别达到71.4%和34.3Vo。可见对同一活性污泥进行硝化和反硝化预处理均可成功启动厌氧氨氧化过程，但硝化预处理更有利于厌氧氨氧化菌的寓集。
关键词：厌氧氨氧化；硝化；反硝化；种泥预处理
厌氧氨氧化(anaerobic ammonia oxidation,Anammox)是一种新型生物脱氮技术，其中Anam-mox菌在厌氧条件下以N02一为电子受体直接将NH。+转化为N2。Anammox过程不仅对海洋环境的氮循环发挥着举足轻重的作用，是污水处理中重要的新型生物脱氮工艺之一。与传统的硝化反硝化工艺相比，它可以节省90%的运行费用。但是，Anammox菌的世代周期相对较长（倍增时间约11 d），因此从普通活性污泥中富集Anammox菌需要很长的时间，这就给Anammox工艺的大规模应用带来较大障碍。
用普通活性污泥富集Anammox菌时，怎样将Anammox菌转化为优势菌种最为关键。从NO。--N的角度来看，它被还原成N：，与反硝化反应相似；从NH。+-N的角度来看，其被氧化成N2，又与硝化反应相似。因此以普通活性污泥作为种泥富集Anammox菌主要有2种方法，一种是先对普通活性污泥进行好氧硝化。如Zheng等培养高活性的硝化污泥后，再用氩气冲洗反应器，通过使反应器严格厌氧来富集Anam-mox菌。另一种方法是对普通活性污泥进行反硝化培养。如Ana Dapena Mora等采用SBR工艺，接种普通活性污泥，在前2个月采用低浓度的NH4+、N02一和高浓度的N03驯化污泥，然后慢慢提高NH4+和N02一，降低N03的浓度来富集Anammox菌。
但是对同一普通活性污泥，2种预处理方法中哪一种更有利于Anammox菌富集并没有得到充分的研究。本研究拟通过对同一普通活性污泥进行硝化和反硝化处理，对比研究适合Anammox菌富集的种泥预处理方法。
1 材料与方法
1.1 接种污泥与模拟废水
普通活性污泥取自厦门市某污水处理厂二沉池。污泥浓度参数如下：MLSS 4.588 g/L，MLVSS 2.916 g/L，MLVSS/MLSS 0.64。
试验用水采用人工模拟废水，其配方见表1。根据Anammox菌富集的情况，保持(NH4)：S04和NaN02比值为(1±0.2)，梯度添加(NH4)2S04和NaN02的投加量。人工模拟的废水采取每天配制以避免其他不必要的干扰因素。调节人工模拟废水的pH值在7.5～8.3。
1.2 实验装置及运行条件
实验采用2套相同的SBR装置（图1），接种污泥后分别进行硝化和反硝化预处理。实验装置主要包括广口瓶、气囊、进水池和出水池。体积为2.5 L，有效体积为2L。种泥硝化预处理过程中，将瓶塞打开，增加曝气装置，每天换水1L，HRT为2d。DO控制参数为2—3 mg/L。反硝化预处理过程中，瓶塞密闭，每天换水1L，HRT为2d，控制COD溶度为50—100 mg/L。Anammox菌富集阶段保持其厌氧环境，控制温度为(35+1)℃，每天换水1 L，HRT为2d。在第90天，向2个反应器投加4g活性炭，为Anammox菌提供附着载体。
1.3 水质分析
试验中各项常规水质测试项目和仪器如表2所示。
1.4 FISH分析
采用原位荧光杂交FISH (Fluorescence in situhybridization)技术检测污泥中的Anammox菌及其丰度。收集含活性炭的污泥样品超声分散1 min，和3倍体积的4%多聚甲醛混合后静置2h。然后用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)清洗，最后加入1 mL 50%PBS和50%无水乙醇中，存储于-20t。PBS(pH 7.4)包含：磷酸二氢钾(KH2P04) 0.24 g，磷酸氢二钠(Na2HP04) 1.42 g，氯化钠(NaCI)8 g，氯化钾(KCl) 0.2 g。
按照Amann的操作方法进行FISH杂交，FISH中所使用的寡核苷酸探针是AMX820(表3)。用激光共聚焦扫描显微镜( LSM710，Carl Zeiss，Germany)检测杂交信号，并用仪器自带图像软件(ZEN 2008Light Edition)分析图像结果。
2 结果与讨论
2.1 硝化和反硝化预处理
将接种污泥分别加入2个相同的SBR反应器中，分别进行硝化和反硝化预处理，硝化中NH4+-N和反硝化中NO。--N的去除率超过70%，即认为硝化菌和反硝化菌处于相对优势地位。图2(a)、(b)分别为硝化预处理时NH。+-N和反硝化预处理时NO。--N的变化情况。从图2(a)中可以看出，NH4+-N的去除率从开始的95%，在第6天增加负荷之后，降低到40%以下。然后在第13天恢复到近72%。硝化细菌丰度逐渐增加，达到硝化预处理目的。从图2 (b)中可以看出，N03一．N的去除率呈逐渐提高的趋势。在第6天增加负荷之后，降低到38%以下。第9天之后，去除率稳定在85%以上。反硝化效果较好，达到反硝化预处理的目的。硝化和反硝化预处理历时14 d。
2.2Anammox反应器启动策略
2个反应装置分别接种普通活性污泥2L(MLVSS 2.916 g/L)。通过FISH分析，Anammox菌的丰度低于检测限。经过2周的硝化和反硝化预处理之后，进入Anammox菌富集阶段，温度、pH、DO分别控制在(35±1)℃、7.5—8.3、<0.1 mg/L。由于在富集阶段N02- -N的浓度超过150 mg/L即会抑制Anammox活性，因此N02- -N的投加量不能太高。Strous等、Dapena Mora等和Ni等均认为应该采用低浓度启动Anammox工艺，但是如果NO。--N的投加量过低，又会造成基质限制生长的情况。本研究通过增加NH4+-N浓度来提高N02 -N的转化效率，当NH4+-N浓度出现负增长的时候，保持(NH4)。SO。和NaNO：比值为(1±0.2)，梯度增加(NH4)。SO。和NaNO。的投加量。TN浓度从120 mg/L增加到260 mg/L，从图中可以看出此阶段没有出现明显的Anammox活性。考虑到可能是由于N02- -N浓度增加过快，又逐步降低进水浓度到120 mg/L．然后再逐步提升负荷。
尽管对进水进行了除氧，但是在换水过程中仍然不可避免的会带人氧气，因此从第90天起，每次换水后，对实验装置均充氩气，保证其厌氧环境。另外，向反应器中投加2 g/L的活性炭，一方面为Anammox菌提供附着的载体，进入活性炭内部的Anammox菌有一个良好的厌氧环境；另一方面，第90天的时候，系统处于Anammox菌的活性提高阶段，系统已基本上完成了淘洗，不适宜厌氧生长的硝化细菌被剔除出系统，与Anammox菌竞争附着环境的微生物减少，提高了Anammox菌对活性炭的利用率。从图3中可以看到，系统的厌氧环境显现，NO。--N从生成转化为去除，NH4+-N的去除由好氧氨氧化细菌(ammoniaoxidizing bacteria，AOB)去除转化为厌氧的Anam-mox菌去除，TN去除负荷增加，说明活性炭的投加有利于Anammox菌的富集。
2.3 启动效果比较分析
图3(a)、(b)分别给出了经过硝化和反硝化预处理之后富集Anammox菌的N02一-N和NH。+-N变化情况。Anammox菌在系统中成为优势菌种的重要标示是N02- -N和NH4+-N的等比例去除。2个反应器在第89天，NO。--N的去除负荷由负转为正，说明系统由硝化反应占主导的体系已经改变，但是此时N02_ -N的去除率非常低，N02- -N和NH。+-N的去除比远远低于1，因此不认为此时Anammox菌富集成功。
2个反应器经过102 d的富集培养之后，NO。一-N和NH。+-N均出现按比例同步去除的现象，Anammox菌富集成功。在102—153 d中，NO。--N和NH4+-N去除负荷逐渐上升并趋于稳定，Anammox菌逐渐成为系统的优势菌种。
图4(a)、(b)分别给出了经过硝化和反硝化预处理之后富集Anammox菌的TN变化情况。图中可以清晰地看到，2个反应器经过102 d的富集培养之后，TN去除负荷均逐步上升。经过硝化预处理后，系统最大去除负荷为0.087 kg/( m3.d)；经过反硝化预处理后，系统最大去除负荷为0.057 kg/(m3．d)，硝化预处理污泥富集Anammox菌的效果明显优于反硝化预处理污泥。在稳定运行的153—161 d中，经过硝化和反硝化预处理之后的2个系统MLSS分别为0.945和1.069 g/L，MLVSS分别为0.231和0.455 g/L，污泥去除负荷分别为0.312和0.106 g/(gVSS -d)，可以认为，硝化预处理系统Anammox菌的丰度比反硝化预处理系统高。可能的原因是对普通活性污泥进行好氧硝化预处理，提高了污泥中AOB的数量，而有些AOB是兼性厌氧菌，无氧条件下可进行类似Anammox作用。另外，AOB会产生羟胺氧化还原酶(hydroxylamineoxidoreductase．HAO)，这种酶有利于Anammox菌的富集。
值得注意的是，经过预处理后污泥流失严重，但是并没有影响系统的处理效果，可能的原因是系统保留了高活性的Anammox污泥。Kieling等认为这是富集Anammox菌的一种污泥选择策略。
在第153天2个系统均出现不同程度的活性下降现象，其中经过硝化预处理的系统下降更为明显。这是由于将装置打开采取污泥样品时引入空气，提高了污泥系统的DO，从而抑制了Anammox菌的活性。可见硝化预处理后的反应系统对DO更为敏感。
2.4 FISH分析
在153 d时，分别从2个反应器中采取污泥样品，经过污泥固定之后，使用激光共聚焦扫描显微镜观察，结果如图5所示。由图5(a)、(b)可知，经过153d之后，2个系统成功富集Anammox菌，硝化预处理污泥富集Anammox菌的丰度高于反硝化预处理污泥。
3 结论与展望
硝化和反硝化预处理污泥均能在102 d内成功富集Anammox菌，且硝化预处理更有利于Anammox菌的富集。稳定运行过程中，硝化和反硝化预处理方式的TN去除负荷分别可达到0.312和0.106g/(gVSS．d)。经过硝化和反硝化预处理后，对富集的Anammox菌属的演替规律需要进一步的研究。另外，普通活性污泥富集Anammox菌的时间，受到起始富集污泥中Anammox菌拷贝数、富集条件、富集方式、HRI、是否添加刺激剂等一系列因素的影响。随着研究人员对Anammox菌的深入研究，富集Anammox菌的时间将不断缩短，最终投向实际应用中。
