柚花不同溶剂提取物抗氧化作用研究

 罗铝铿1*．郭佳茵1，刘家丽1，刘孟华2

 1．嘉应学院医学院(梅州514015)；2南方医科大学药学院（广州510515）

摘要研究分别采用DPPH法、邻苯三酚自氧化法、邻二氮菲-Fe2+研究柚花水提物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物清除DPPH自由基、超氧自由基和羟自由基的能力。结果表明柚花提取物均对DPPH自由基、超氧自由基和羟自清由基有除能力，并在一定浓度范围和清除率成线性正相关。柚花提取物均具有清除自由基的能力，其中水提取物和乙醇提取物抗氧化能力较好。

关键词柚花；抗氧化；羟自由基；超氧自由基；DPPH

  柚花又称橘花，为芸香科植物柚(Citrus grandis(L．) Osbecd)的花或花蕾，香气悠长，具有行气、除痰、止痛的功效，可作为花茶饮用。其来源丰富，据不完全统计，中国拥有柚的品种达120个以上，广泛分布于中国亚热带地区，四川、广东、广西、福建、湖南、江西等地均有大面积种植。柚树开花期需进行疏花，大约95%的花需要疏去，由于目前关于柚花的研究极少，大量的疏花被废弃，造成了资源的严重浪费。

 人体新陈代谢会产生大量的自由基，包括超氧自由基、羟自由基等，据研究自由基可以引起动脉粥样硬化、老年痴呆等100多种疾病，是生物体衰老的主要因素之一，从天然果蔬及中草药中开发安全无毒的抗氧化剂是目前发展的趋势。试验采用不同极性溶剂直接对柚花进行提取，采用用多种抗氧化活性评价方法评价不同总提取物抗氧化活性，测定不同溶剂提取物中黄酮、多酚、酚酸含量并分析相关性，以期为柚花相关产品的研发提供可靠的试验数据和理论依据。

1  材料与方法

1.1材料、仪器与设备

 柚花：2014年4月采自梅州市石马镇；二苯代苦味酰基自由基( DPPH)：分析纯，Sigma化学有限公司（美国）；邻苯三酚，分析纯：Sigma化学有限公司；芦丁：色谱纯，上海亿欣生物科技有限公司；邻二氮菲、过氧化氢、硫酸亚铁、三氯化铁、十二烷基磺酸钠、铁氰化钾、酒石酸钾钠、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯均为国产试剂，分析纯。

 72 1型紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅。

1.2试验方法

1.2.1柚花不同溶剂提取物的制取

 方法略作改动。将新鲜采摘的柚花置于40℃烘箱中烘干，分别用10倍剂量的水、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚加热回流提取1h，滤渣再用10倍剂量的溶剂提取1h，合并两次滤液，将提取液减压浓缩，干燥至恒重备用，按公式(1)计算不同提取方法出膏率，并配制成不同浓度溶待用。

 出膏率=干膏质量/药材质量×100% (1)

1.2.2清除DPPH自由基能力的测定

 方法略作改动。将由1.2.1制得的不同溶剂提取物用无水乙醇溶解并配制为一系列不同浓度受试样品乙醇液分别取2.0 m L待测液与的2.0 m L 0.2 m mol/L DPPH乙醇溶液混合，振摇均匀后，于518 nm处测定吸光度(Ai)同时测2.0 m L 0.2 m mol/L DPPH溶液与2.0 m L无水乙醇混合液的吸光度（Ai），以及2.0 m L待测液与无水乙醇混合液的吸光度(Ac)。每样测定3次并取平均值，按公式(2)计算DPPH自由基清除率。以芦丁为对照进行比较。

1.2.3清除超氧自由基O2-能力的测定

  方法参考文献并略作改动。配制待测液浓度为2mg/L，取10 m L比色管依次加入3 m L PBS缓冲液(pH8.4)，3 m L 0.05 m mol/m L邻苯三酚溶液，0.5 m L待测液，加三蒸水稀释至刻度，每隔30 s测其在325 nm处的吸光度，共6 min，绘制曲线计算得到样品氧化速率斜率K1；将待测液以三蒸水代替，同样条件下测其吸光度，并计算。作图分别计算出邻苯三酚自氧化速率K0，根据公式(3)计算清除率。以芦丁为对照进行比较。

1.2.4清除羟自由基能力的测定

  采用邻二氮菲_Fe2+氧化法测定柚花提取物清除羟自由基的能力。在试管中依次加入0.2 m mol/LPBS，去离子水1 m L摇匀，加入0.75 m mol/L FeSO4，1 m L，充分混匀；加入0.01% H2O2，震荡1 min;加入0.75 m mol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1 m L，37 0C水浴60 min。于535 nm处测定吸光度A p；以不同浓度样品溶液代替去离子水，测定吸光度As；以去离子水代替H2O2，测定吸光度A b；每样测定3次取其平均值，按公式(4)计算羟自由基清除能力。以芦丁为对照进行比较。

1.2.5黄酮含量测定

 依据2010年版《中国药典》检测芦丁含量。精密称取芦丁标准品20.0 mg，置100 m L的棕色容量瓶中，加70%乙醇微热溶解，冷却至室温，用70%乙醇稀释至刻度。摇匀，制得对照品0.20 mg/m L的芦丁。精密移取芦丁对照品0.0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 m L，置25 m L容量瓶中，各加蒸馏水5.0 m L，加入5%的NaNO2溶液1.0 m L，摇匀放置6 min，加入10% Al(NO3)3 1.0m L，放置6 min，加入4% Na OH 10.0 m L，用70%的乙醇定容至刻度，放置15 min。用空白试剂作对照，在510 nm处测吸光度。以芦丁含量(mg/m L)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。得到回归方程为y=12.446x+0.012 9,R2=0.999 9。

 准确移取1.0 mg/m L提取物溶液1.0 m L分别置于25m L的容量瓶中根据标准曲线制作方法测定四份样品的吸光度，根据回归方程计算黄酮含量。

1.2.6总酚酸含量测定

 方法略作改动。精密称取没食子酸29.6 mg于小烧杯中，用无水乙醇溶解，25 m L容量

瓶中定容，准确移取1.0 m L于50 m L容量瓶中定容，配成23.68 μg/m L的对照品溶液。精密移取对照品0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 m L分别置于25 m L容量瓶中，加无水乙醇至25.0 m L，加入0.3%的十二烷基磺酸钠2.0 m L, 1%的铁氰化钾和1%的三氯化铁(1：1)混合2.0 m L，摇匀，暗处放置5 min，加0.10 mol/L的盐酸至25.0 m L，摇匀，暗处放置20 min，平行空白，用紫外分光光度计在740 nm处测量吸光度。以吸光度为J，，浓度为x，建立回归方程：y=0.846 8x-0.034 5，R2=0.999 7。

  准确移取1.0 mg/m L提取物溶液0.3 m L分别置于25m L的容量瓶中根据标准曲线制作方法测定样品吸光度，根据回归方程计算总酚酸含量。

1.2.7多酚含量测定

  本方略作改动。移取3.6 m L 0.10mol/L的硫酸亚铁置小烧杯中，准确称取0.5 g酒石酸

钾钠，混合后加蒸馏水溶解，定容到100 m L，并于低温，避光环境中保存。准确吸取0.20 mg/m L的对照品0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 m L分别置于25 m L容量瓶中，加蒸馏水至5.0 m L，再加入5.0 m L酒石酸亚铁溶液充分混合，再加入pH 7.6的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，充分混匀，静置15 min，在波长540 nm处测定A，同时以蒸馏水作为参照。以吸光度为y，浓度为x，建立回归方程：y=6.75x+0.045 7．R2=0.998 2。

  准确移取1.0 mg/m L提取物2.0 m L分别置于25 m L的容量瓶中根据标准曲线制作方法测定样品吸光度，根据回归方程计算多酚含量。

1.2.8数据分析

  IC50指当自由基清除率达到50%时的样品浓度，以提取物浓度为自变量，自由基清除率为因变量进行线性拟合分析，根据线性公式计算IC50。采用SPSS16.0以相关系数法和p检验，对四种提取物的主要成分含量( mg/m L)与自由基清除率IC50值(%)进行相关性分析。

2结果与分析

2.1不同极性溶剂提取方法出膏率

  出膏率是衡量提取效率常用的指标之一，从结果来看，不同极性溶剂提取出膏率相差较大，次序为水>无水乙醇>乙酸乙酯>石油醚，结果见表1。

2.2对DPPH自由基清除率

  DPPH是目前应用最广泛的评价果蔬抗氧化能力方法之一。四种提取物对DPPH自由基都有一定的清除能力，随着浓度的升高，不同提取物对DPPH自由基的清除率也逐渐增强，并呈良好的线性关系，结果见图1，通过回归方程计算得出四种提取物的半清除率IC50见表2。四种提取物对于DPPH自由基都有弱的清除作用，相对于其他三种提取物，其中无水乙醇

提取物半清除率最小，说明其对DPPH自由基清除能力较强，而石油醚提取物抗氧化能力最弱。

2.3对超氧自由基的清除率

 超氧自由基具有较强的毒性，是体内产生的主要自由基之一，可以转化为多种其他自由基。柚花不同溶剂提取物对超氧自由基的清除率在一定范围内与浓度呈线性正相关，绘出相应曲线，计算IC50。结果见图2及表3。结果表明，柚花提取物具有一定的超氧自由基清除能力。柚花不同溶剂提取物对超氧自由基均有一定的清除能力，乙醇提取物>乙酸乙酯提取

物>水提物>石油醚提取物。

2.4对羟自由基清除率

 试验结果表明，柚花不同溶剂提取物对羟自由基的清除率在一定范围内与浓度呈线性正相关，绘出相应曲线，计算IC50。结果见图3及表4。柚花不同溶剂提取物均对羟自由基具有一定的清除力，按清除力大小依次为：水提取物>乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。

2.5  柚花不同溶剂提取物总黄酮、总多酚和总酚酸含量

  通过对柚花不同溶剂提取物中有效成分检测发现，不同提取物中有效成分含量相差较大。黄酮和总酚酸在无水乙醇提取物中含量为最多，多酚在水提物中含量最多，而这三种成分在石油醚中均含量最少，结果见表5。

2.6相关性分析

 将3种不同体系评价得到的抗氧化能力分别与四种提取物的总黄酮、总酚酸和多酚的含量作相关性分析，结果如表6所示。黄酮和酚酸的含量与三种方法测得的IC50值相关性均较弱，多酚含量与DPPH，邻二氮菲羟自由基清除两种测定方法测得的IC50相关性较弱，而与超氧自由基清除测定方法测得的IC50值呈显著相关，R2=-0.986( p<0.05)。

3结论与讨论

 在DPPH清除自由基的体系中，抗氧化能力强弱顺序为：无水乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物；在羟自由基清除体系中，抗氧化能力强弱顺序为：无水乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物；在超氧自由基清除的体系中，抗氧化能力强弱顺序为：水提取物>无水乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。和维生素C相比，柚花不同溶剂提取物抗氧化能力均较弱。

 黄酮、酚酸的含量与三种方法测得的lC50值相关性均较弱，多酚含量与DPPH、邻二氮菲羟对自由基清除两种测定方法测得的IC50相关性较弱，而与超氧自由基清除测定方法测得的lC50值呈显著相关，R2=-0.986( p<0.05)，提示多酚可能是清除超氧自由基的主要有效成分，且柚花提取物抗氧化能力不仅与其有效成分的含量有关，可能还与种类有关。

 柚花香气悠长，在古代就已经被用作香料，是清代宫廷化妆品面脂的原料之一，《本草纲目》言其“可使长发润泽”，也可作为花茶食用。天然，高效，安全的抗氧化剂是目前食品发展的方向，试验证明柚花具有一定的抗氧化能力，且活性物质多集中在水相和乙醇相中，综合出膏率，成本及溶剂残留等因素，水是提取柚花中抗氧化功效成分的较好溶剂，研究结果为柚花系列食品及饮料研发提供理论依据。