杨阳1，巫水华1*，陈安徽1，刘恩岐1，单秋丽2，李继武3
1．徐州工程学院，江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室（徐州221111）；
2．济南大学生物科学与技术学院（济南250002）；3．亳州千草药业有限公司（亳州236000）
摘要对黄精提取物不同极性组分的体外抗氧化活性进行研究。以70%乙醇为溶剂，利用闪式提取器对黄精进行提取，并依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对黄精醇提物进行分级萃取，采用测定总还原力的大小和DPPH．、．OH、O2-·及ABTS+．清除率等指标来评价黄精不同极性组分的抗氧化能力。结果表明，黄精不同极性组分均有较强的总还原力和清除自由基的能力，并呈明显的量效关系。其中水相的总还原力最高且对.OH清除效果最好，乙酸乙酯相清除DPPH．和ABTS+．效果最好，正丁醇相清除O2-．效果最好。试验结果提示黄精各个极性组分均具有一定的抗氧化效果，是天然抗氧化剂的良好来源。
关键词黄精；提取物；体外；抗氧化
生物体在新陈代谢过程中会产生一些自由基，在正常情况下它们处于低水平的平衡状态，具有一定的作用，但在病理情况下活性氧代谢过剩时，自由基由于其氧化能力强、反应活性高，给人体健康带来很大的危害。大量研究表明，自由基与心血管疾病、糖尿病和癌症等疾病存在联系。随着年纪增长、环境恶化等因素的影响，人体清除自由基的能力下降，导致自由基在人体内堆积，人体免疫力下降进而引发一系列疾病。因此，寻求一种能清除自由基的天然抗氧化剂具有重要研究意义。
黄精（Polygonatum sibiricum Redoute）为百合科草本类植物，是我国一种传统的中药，其药用历史已有2 000多年，其具有宽中益气、益肾填精、滋阴润肺以及生津补脾等功效，多用于咳嗽、免疫力低下以及肺部疾病的治疗。当代药理学研究表明，黄精中的主要活性成分有多糖、黄酮类物质、皂苷类物质、生物碱、木质素和氨基酸等，这些活性成分具有抗氧化、延缓衰老、降低血糖、降低血脂、调节免疫力、强心、抗炎、提高和改善记忆力等生理功能。目前，国内外对黄精多糖和皂苷的研究报道较多，而对于其他成分的研究鲜有报道。
用极性不同溶剂对黄精醇提物进行分级萃取，得到不同极性萃取相，通过测定各个组分的总还原力大小和DPPH．、．OH、O2-·及ABTS+．清除率等指标，综合评价黄精提取物不同极性组分的体外抗氧化能力，为进一步开发利用黄精资源提供科学依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
黄精：亳州千草药业有限公司；DPPH:美国Sigma公司；ABTS：Amresco公司；其余试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
ZHBE-50T闪式提取器：河南智晶生物科技发展有限公司；R206旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司：723C可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计：北京普析通用有限公司；TDL-80-2B离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3方法
1.3.1黄精提取物的制备
黄精经粉碎后，过100目筛，称取一定量的黄精粉，按料液比为1：25(g/m L)加入70%乙醇，利用闪式提取器（电压100 V，档速4），提取3次，每次1 min,过滤，滤液于50 ℃下减压浓缩，回收乙醇，得到深褐色浆状物，即为黄精提取物。
1.3.2不同极性组分的分离
取一定量的黄精提取物，溶于纯水中，充分震荡分散后，移入分液漏斗中，加入200 m L石油醚，震荡摇匀，静置分层后保留上层石油醚相，下层水相使用同样的方法萃取2次，合并3次石油醚萃取液，于45℃下减压浓缩，回收石油醚，得到黄精提取物的石油醚相。石油醚萃取后的剩余水溶液按照上述方法用乙酸乙酯萃取3次，合并3次乙酸乙酯萃取液，于50℃下减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到黄精提取物的乙酸乙酯相。乙酸乙酯萃取后的剩余水溶液按上述方法用正丁醇萃取3次，合并3次正丁醇萃取液，于70℃下减压浓缩，回收正丁醇，得到黄精提取物的正丁醇相。正丁醇萃取后的水溶液于60℃下减压浓缩，得到黄精提取物的水相。
1.3.3不同极性样品溶液的制备
准确称取黄精提取物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相4个部分样品，溶于70%乙醇溶液中，避光低温保存备用。
1.3.4还原力的测定
参照吴峰华等的方法，并作适当的修改。取不同浓度的各样品溶液1.0 m L，分别加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液( pH 6.6) 2.5 m L和1%的铁氰化钾溶液2.5 m L，混匀，50℃水浴中保温20 min，然后加入2.5 m L 10%的三氯乙酸溶液，混匀后于3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 m L，再加入2.5 m L蒸馏水和0.5 m L 0.1%的三氯化铁溶液，于700 nm处测定吸光度，吸光度越大表示还原力越大。
1.3.5 DPPH．清除率的测定
参照Brahmi等的方法，并作适当改动。取不同浓度的各样品溶液1 m L于试管中，分别加入3 m L 0.04mg/m L的DPPH溶液（无水乙醇配制），于室温下避光反应30 min后，用无水乙醇作空白，在517 nm下测定吸光度A1，同时用蒸馏水代替样品溶液测得吸光度A0，1 m L样品溶液与3 m L乙醇溶液的吸光度A2，清除率按照式(1)计算。
1.3.6ABTS+．清除率的测定
参照高忠梅等的方法，并做适当改进。
ABTS+．工作液的制备：精密移取7 m mol/L的ABTS溶液2.5 m L与7.35 m mol/L的过硫酸钾溶液2.5 m L混合后，在室温下黑暗处放置12 h，用无水乙醇稀释40～50倍，于734 nm处测定吸光度，为0.70±0.02，即得ABTS+．工作液。
测定步骤：取不同浓度的各样品溶液0.2 m L置于比色皿中，分别加入1 m L ABTS+．工作液，混合后，避光放置反应6 min后，用无水乙醇作空白，于734nm处测定吸光度A，以无水乙醇代替样液测得吸光度A0，清除率按式(2)计算。
1.3.7 ·OH清除率的测定
参照张海晖等的方法，并做适当改进。取不同浓度各样品溶液1mL于试管中，分别加入1 m L 9m mol/L的FeSO4溶液和1 m L 9 m mol/L的水杨酸一乙醇溶液，最后加入1 m L 8.8 m mol/L的H2O2溶液启动反应。用蒸馏水作空白，在510 nm处测定吸光度A1，同时用蒸馏水代替样品溶液测得吸光度A0，不加显色剂H2O2溶液的吸光度A2，清除率按照式(3)计算。
1.3.8 O2-·清除率的测定
采用邻苯三酚自氧化法，参照贾长虹等的方法，并做适当改动。取2 m L待测样品溶液置于试管中，加入50 m mol/L pH 8.2的Tris- HCl溶液5 m L，置于25℃水浴中保温10 min，然后加入0.1 m L 25 0C预热好的6 m mol/L的邻苯三酚溶液，迅速摇匀后，于320 nm下每隔30 s测定吸光度，直到反应6 min为止，计算线性范围内每分钟吸光度的变化△A，以蒸馏水代替样品溶液测定吸光度变化△A0，清除率式(4)计算。
1.4半数抑制率(IC50)的计算
以样品的浓度对吸光度或自由基清除率作图并进行线性拟合，计算IC50。IC50定义为吸光度为0.5或清除率为50%时样品的浓度。
1.5数据处理
所有试验均重复3次以上，并采用SPSS 19.0软件对进行数据处理，以p<0.05判断为有统计学意义；使用EXCEL软件绘制曲线。
2结果与分析
2.1 黄精不同极性组分提取物的总还原力
总还原能力是评价提取物抗氧化能力的重要参考，试验以普鲁士蓝的生成量作为指标，当体系中存在抗氧化剂时会将六氰合铁酸钾还原成亚铁氰化钾，然后利用Fe3+形成Fe4[Fe(CN)6]3，在700 nm处测定吸光度的变化大小来检测还原力大小。由图1可知，黄精不同极性组分的提取物均有不同程度的还原力，且都有明显的量效关系，即浓度越大，还原力越强。由表1可知，各极性组分的总还原力由大到小依次为：水相>正丁醇相>石油醚相>乙酸乙酯相。水相的IC50显著小于正丁醇相、石油醚相和乙酸乙酯相(p<0.05)，乙酸乙酯相和石油醚相的IC50之间无显著性差异(p>0.05)，说明乙酸乙酯相和石油醚相还原力相差不大。这表明黄精提取物各组分都能提供一定的氢原子，表现出较强的总还原能力。
2.2黄精不同极性组分对DPPH．的清除能力
DPPH．是非生理性自由基，它以氮为中心的稳定的自由基，当溶液中的抗氧化剂提供氢原子时，DPPH．中的孤对电子被配对而使得溶液颜色变浅，在517 nm处吸光度变小。由图2可知，黄精的不同极性组分提取物均有较强的清除DPPH．的能力，并且存在着明显的量效关系，即浓度越大，清除效果越好。由表1可知，清除DPPH．的能力由大到小依次为：乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>石油醚相。其中乙酸乙酯相IC50显著小于正丁醇相、水相和石油醚相(p<0.05)，但与正丁醇相的IC50之间无显著差异(p>0.05)，表明正丁醇相与乙酸乙酯相清除DPPH．的能力相当，水相次之，石油醚相清除能力最弱。
2.3黄精不同极性组分对ABTS+．的清除能力
ABTS+．清除率是快速、有效测定天然产物抗氧化能力的方法。由图3可以看出，黄精不同极性组分的提取物均具有不同程度的清除ABTS+．的能力，且清除效果呈显著的量效关系，即浓度越大，清除ABTS+．效果越好。同时由表1可看出，清除ABTS+·的能力由大到小依次为：乙酸乙酯相>水相>正丁醇相>石油醚相。乙酸乙酯相IC50显著小于水相、正丁醇相和石油醚相(p<0.05)，同时正丁醇相和水相的IC50之间无显著差异(p>0.05)，表明正丁醇相
与水相清除ABTS+．的能力相当。
2.4黄精不同极性组分对．OH的清除能力
天然活性物质清除．OH的能力直接与其抗氧化能力相关。利用H2O2与Fe2+混合后通过Fenton反应产生．OH，在体系中加入水杨酸来捕捉.OH产生有色物质，当溶液中存在抗氧化剂时，.OH被清除，从而有色物质生成量减少，导致在517 nm处吸光度减小。由图4可以看出，黄精不同极性组分的提取物均具有不同程度的清除．OH的能力，且清除效果呈显著的量效关系。由表1也可看出，清除．OH的能力由大到小依次为：水相>乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相。其中石油醚相的IC50约为水相的IC50的30倍，同时水相的IC50显著小于正丁醇相、石油醚相和乙酸乙酯相(p<0.05)。
2.5黄精不同极性组分对O2-·的清除能力
邻苯三酚在弱碱的条件下会发生自氧化产生O2-．，在325 nm处有最大吸收。当溶液中存在抗氧化剂时，O2-·被清除，在517 nm处吸光度减小。由图5可以看出，黄精不同极性组分的提取物均具有不同程度的清除O2-·的能力，且清除效果呈显著的量效依赖关系。由表1可看出，清除O2-·的能力由大到小依次为：正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚相>水相。正丁醇相的IC50显著小于乙酸乙酯相、石油醚相和水相(p<0.05)，同时乙酸乙酯相和石油醚相的lC50之间无显著性差异(p>0.05)，说明乙酸乙酯相和石油醚相对O2-·的清除能力相当，这与总还原力结果一致。
3结论与讨论
试验结果表明，黄精不同极性组分均具有抗氧化活性，且总还原力和清除自由基的效果均呈现有显著的量效关系，同时各个组分的还原力和清除自由基能力等指标存在差异，其中水相的总还原力和清除．OH的能力最高，IC50分别为0.543±0.018 mg/m L
和0.056±0.020 mg/m L;乙酸乙酯相清除DPPH．和ABTS+．效果最好，IC50分别为0.050±0.001 mg/m L和0.052±0.002 mg/m L，正丁醇相清除O2-·效果最好，IC50为0.047±0.013 mg/m L;乙酸乙酯相和石油醚相总还原力和清除O2-．的能力相当，正丁醇相清除DPPH．能力与乙酸乙酯相相当，水相清除ABTS+.能力与乙酸乙酯相当。还原能力和清除自由基能力的差异可能与黄精不同极性组分中的活性物质种类（多糖类和类黄酮物质）和结构的不同有关，分部进行不同极性的活性物质溶解在不同的极性溶剂中，从而导致不同组分清除自由基能力存在差异。另外，黄精不同极性组分的抗氧化作用对不同类型的自由基也表现出选择性作用，其相关机理有待进一步研究。
总体来看，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的抗氧化作用好，因此，可对其活性物质进一步分离，以确定黄精抗氧化作用的物质基础。
