张文静， 李琼芳， 张存凯， 张伟， 杨丽君
（1．西南科技大学生命科学与-程学院，四川绵阳621010；
2．西南科技大学分析测试中心，四川绵阳621010；
3．西南科技大学同体废物处理与资源化教育部重点实验室，四川绵阳621010）
摘要：为探究四川黄龙钙华地貌高寒水体中低温微生物对碳酸钙沉积的影响，该试验自黄龙钙华水体中分离到2株具有高产碳酸酐酶(CA)活力的嗜冷型菌株，在不同的初始pH值和不同的低温沉积温度下，通过测定沉积体系pH值和电导率的变化来研究菌株对碳酸钙沉积过程的影响，并用X射线衍射仪( XRD)、红外光谱仪(FT-IR)和扫描电子显微镜(SEM)对生成的碳酸钙晶体进行晶型晶貌分析。结果表明：供试菌株在不同条件下都能促进碳酸钙沉积，形成的晶体均为方解石型，但其形貌却不尽相同尤其在初始pH值8.0，10℃低温下对碳酸钙沉积的影响最为显著。研究结果表明供试嗜冷型碳酸酐酶产生菌株能在一定程度上调控碳酸钙的沉积速率与晶体形貌结构，其结果可为探究低温下黄龙钙华的生物沉积机制提供一定的理论基础。
关键词：嗜冷型碳酸酐酶产生菌；低温；碳酸钙沉积；晶型晶貌
碳酸盐是一种自然界普遍存在的高活性组分，是一种广泛存在的生物矿物。生物矿化沉积碳酸盐的现象在自然界是普遍存在的，其中又以生物矿化碳酸钙( CaC03)为主。而碳酸钙的沉积在自然界中极为缓慢，可以利用生物酶一碳酸酐酶(CA)来催化C02的可逆水合反应：C02+H20+CaC03'—+Ca2++2HC0:3~21。近年来已有研究微生物CA诱导的矿化作用对碳酸钙形成的影响的相关报道。而CaC0;3沉积研究所使用的微生物种类很多，大部分是从淡水、海洋、土壤和高盐度的环境中筛选出来的。已报道的能沉积碳酸盐的微生物有嗜碱和嗜盐微生物、尿素分解细菌、芽孢杆菌、硫酸盐还原细菌、黏细菌、蓝细菌等。
黄龙钙华景观作为著名的世界自然遗产，目前认为钙华主要由物理及水化学作用产生的，而生物因素在钙华形成过程中也起到了一定的作用。在生物成因中，由于藻类庞大的数量及其独特的代谢方式，其对碳酸钙沉积的影响已有学者做出相应的研究。而前期研究发现，黄龙水体中的细菌数量也极为可观，仅可培养细菌就达到l.Oxl06 cfu/mL，而这些细菌必然会或多或少地参与到钙华的沉积过程中。近年来，利用微生物对生物矿化碳酸钙沉积的研究已日益得到人们的关注。例如，Baskar等研究表明嗜碱土壤微生物巴氏芽孢杆菌（Bacillus pasteurii）在沙土中诱导方解石沉积；分离于微生物岩( Microbialite)中的蓝细菌在碱性条件下能够在细胞内部合成无定形碳酸盐补充了微生物诱导矿物形成的途径。然而，对存在于水体中的大量嗜冷微生物（如嗜冷型碳酸酐酶产生菌），其生命活动在钙华沉积过程中的参与程度鲜有报道。本试验以分离自黄龙高寒钙华水体中的嗜冷型产碳酸酐酶细菌作为研究对象，探索在不同条件下供试菌株对CaC0.3沉积的影响作用，为黄龙钙华的生物成因及对提出防止钙华退化的保护治理措施具有重要意义，并为深入研究低温下微生物CA催化CaC03的沉积作用奠定一定的理论基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株及其培养基
选取本实验室从黄龙钙华沉积区水体中筛选得到的两株嗜冷型高产碳酸酐酶细菌做为供试菌株，菌株编号为15-33和18-10，菌株编号是依据黄龙风景区钙化池的编号而定的，15和18分别为五彩池和金沙铺地的编号；33和10分别为所属钙化池里筛选菌株的编号。该菌株经前期大量试验探究得出在10℃、pH 8.0条件下产碳酸酐酶活力最高。菌株的培养和活化均采用牛肉膏蛋白胨培养基。水体钙化池的性质如表1所示。
1.1.2主要试剂及仪器
主要试剂CaCI2、Na2C03均为分析纯。主要仪器：美国ThermoFisher赛多利斯BSA124S型分析天平、BANTE PHS-3CW台式数显pH计、DDS-307+电导率仪、荷兰飞利浦X- Pert PRO型X射线衍射仪(XRD)、Nicolet-5700(傅里叶变换)红外光谱(FI'-IR)和LeicaCambridge LTD S440型扫描电子显微镜(SEM)。
1.2实验方法
将菌株15 -33和18 -10活化后的菌液分别按2%的比例接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在150 r/min、10℃下培养48 h，与50 mmol/L CaCI2和50 mmol/L Na2C03溶液，按体积比为1:1:1的体系设置，将体系的初始pH分别调为6.0、7.0、8.0、9.0，在10℃下进行沉积试验。待确定最适pH后，以其作为最佳起始pH条件，再将体系分别置于温度为5、10、15、20℃下进行沉积试验。实验持续72 h，以上每个处理重复3次。在试验的第0小时开始取样，12 h前每2h取一次样，12 h后每12 h取一次样，检测pH值和电导率的变化。试验结束后收集沉淀，沉淀用超纯水洗涤、过滤，待自然干燥后分析所得沉淀的晶型晶貌。
2结果与分析
2.1不同条件下沉积过程中pH的变化
不同的初始pH条件下：pH对碳酸钙沉积有着很大的影响，试验菌株产生的CA催化C02的可逆水合反应，反应式如下：C02+H20+CaC03<—r+Ca2++2HC03一，生成的H+会影响CaC03的电离平衡，从而影响体系中碳酸钙的沉积与溶解，进而改变体系的pH值。对不同初始pH值下碳酸钙沉积过程中体系pH的变化进行分析，pH变化关系图如图1(a)~(b)中所示。2组试验组和对照组的pH变化趋势几乎一致。不同之处在于，对照组的pH从初始9.0几乎一直在下降，直到80 h仍表现为下降，而试验组的pH 9.0在34 h前在下降，34 h后就几乎保持稳定。试验组pH 6.0、7.0和8.0组都在22 h前表现出不同幅度的向上增长趋势，在22 h后就几乎平稳，最后稳定在7.94～8.2之间；而对照组在22～34 h仍在增长，到34 h后最终稳定在7,85—8.26之间；可见，试验组的pH比对照组的pH稳定的时间提前了12 h，说明菌液里的CA促进了C02的溶解，促进了CaCO。的电离平衡。对该pH变化原因的分析可能是，在低pH值(6.0、7.0、8.0)条件下，pH值上升是由于反应刚开始C02的大量溶解以及Ca2+不断转变为CaC03而溶液中加的C032-就与生成的H+结合，使得溶液中的OH-析出，pH增高，随着溶液中Ca2+的消耗，pH达到动态平衡。而初始pH 9.0的实验组中，pH的降低，可能是因为初始pH较高，更有利于C02的溶解，从而促使CaC03的生成，细菌代谢产生了酸性物质，使得溶液pH降低，而随反应的不断进行，溶液中沉积反应稳定后pH也逐渐趋于稳定。
不同的沉积温度下：两组试验组的pH变化几乎一致，与对照组类似。碳酸钙沉积体系pH在0—2 h中急剧上升，在2h后pH都趋回7.7—8.2之间。在5℃和20℃体系的pH值比10℃和15℃的波动更大，而10℃下pH的变化更平稳些。且实验组的变化比对照组更显著些，可能是因为试验组中所添加入细菌的碳酸酐酶活性在10℃时最高，因此此时在实验菌株产生的碳酸酐酶作用下，对pH值产生了一定的影响作用(如图1(c)~(d))。
由图1还可以看出，在不同处理条件下，pH值都趋于8.0左右，且在图1(a)~(b)中，初始pH为8.0的pH值一直处于8.0左右，几乎能维持平衡，说明在碳酸钙的沉积过程中，pH 8.0对沉积影响不大，且更有利于沉积进行。
2.2不同条件下沉积过程中电导率的变化
电导率参数表征了溶液中游离态离子的总浓度。试验前后溶液电导率的降低反映了溶液体系中导电离子结合成不导电物质的一个过程。实验中电导率的变化主要是Ca2+与C032-离子结合形成CaC03晶体沉积，导致溶液中离子浓度的减少，导电能力的降低。在不同初始pH值条件下，电导率的变化趋势大致相似，都表现为降一升一降三段式曲线，如图2(a)所示。0—6 h电导率急速下降，6—48 h电导率又缓慢上升，48 h后又下降，后趋于稳定。原因可能是刚开始游离的C032-和Ca2+都比较多，较快的发生了化学沉积；随着反应的进行，体系中的碳酸酐酶促进了C02的溶解、细菌酸性代谢产物的产生、体系pH的降低(如图1中22—48 h)，导致生成的CaC03沉积又发生了溶解，但最高点处的电导率仍小于沉淀初始的电导率，表明第1次的电导率下降主要是化学行为，第2次下降主要是生物行为，且由于细菌及其代谢产物的成核及聚集作用，导致第2次沉积更彻底，因而最后的电导率低于第1次沉积的电导率。
在不同温度条件下，电导率的变化类似，关系如图2(b)所示。0—2 h电导率急剧下降，2—48 h电导率相对稳定，48 h后电导率又急剧下降至稳定。可能是由于不同温度下的pH是恒定的，比较稳定，有利于维持离子浓度的稳定。还可以看出，在相同时间段内试验组的电导率大于对照组，说明细菌菌体的加入活跃了沉积体系，导致电导率上升，分析原因可能是细菌代谢将培养基中的有机质转变为酸性物质，从而溶解了部分碳酸钙晶体。整个试验在72 h时电导率最小，即体系离子浓度已经趋于最低，稳定的生成了CaC03晶体。
2.3不同条件下得到的碳酸钙晶体晶型晶貌
2.3.1 碳酸钙的XRD图谱
不同条件下得到的晶体用XRD检测得到的图谱都在20=23.10、29.50、36.10、39.50、43.20、47.60和48.6。等位置附近出现了特征衍射峰，对照标准卡片可知其产生的碳酸钙沉淀晶型为方解石，其晶面基本相同，有(012)、(104)、(110)、(113)、(202)、(018)和(116)等晶面，其中优势晶面为( 104)（如图3所示）。XRD图谱分析结果表明，在不同的初始pH值和不同的温度条件下，对生成的碳酸钙晶体的晶型影响不大。
2.3.2碳酸钙的FT-IR图谱
不同条件下生成的碳酸钙晶体用FI'-IR检测得到的图谱均在波数为1420、875、712 cm-1处出现了明显的峰，（如图4所示），这些峰均为方解石的特征峰，这与XRD图谱结果一致。由图4还可以看出，实验组特征峰较对照组发生了蓝移，如在图4(a)中，由对照组的1418.43 cm-1分别偏移到了1 419.21和1 420.84 cm-1。蓝移可能是由于有机质提供了碳酸钙的成核位点，也可能是由于供试菌株的细胞本身或分泌物在沉积过程中起了聚集及成核作用。
2.3.3碳酸钙的SEM图谱
不同条件下得到的碳酸钙样品的SEM图谱中，样品CaCO。颗粒直径分布在1～10um之间，形貌、大小、堆积密度存在明显差异。不同初始pH值下得到的样品SEM图中，对照组CaC03颗粒形貌呈无规则块状以及球状，表面粗糙，实验组CaC03颗粒形貌呈菱形、长方体形、花瓣形以及一定比例的规则斜六方体，表面具有多层重叠结构特征，(图5(a)~(c)所示）。在不同温度下得到的样品SEM图中，对照组CaCO。颗粒形貌有菱形和无规则块状体，分布杂乱无章。实验组晶体大部分呈花瓣形，黏连在一起(图5(d)~(f)所示）。可见在不同条件下，由于加入菌液使得晶体形貌都由常见的不规则形和菱形变为花瓣形和六方体形，说明菌株对生成的碳酸钙的晶体形貌有一定的调控作用。
3结论
(1)在碳酸钙沉积过程中，pH对碳酸钙的沉积有一定的影响。在不同的初始pH和温度下，pH最终趋近于8.0左右，由此得出在pH 8.0左右有利于碳酸钙的沉积。而温度在10℃时比其他温度下对沉积的影响更小，即温度为10℃下更有利于碳酸钙沉积的形成。这与菌株本身在10℃、pH 8.0 F有最高的酶活性的代谢机制一致，也与竹文坤等研究的单因素对碳酸钙沉积的影响结果一致，说明菌株在不同的初始pH值和沉积温度下对碳酸钙的沉积有一定的调控作用。
(2)温度对沉积生成的碳酸钙的晶体形貌有着较大的影响作用。沉淀物的晶型均为为方解石型，其晶体形貌和堆积密度随外界条件改变而不同，晶体形貌有菱形、花瓣形、长方体形和无规则块状体。尤其是在不同的温度下，晶体形貌受温度影响很大，这与Prah等的研究结果一致。生物的作用使晶体间发生了黏连，这对利用细菌诱导碳酸钙沉积进行材料的表面修复工作十分有利。实验组比对照组有更规则的晶型，说明加入的供试菌株对碳酸钙晶体生长和形貌的形成有一定的控制作用。
