生物硫铁复合材料对铜暴露斑马鱼的保护研究

 周婧超，  谢翼飞，  杨阳，  李旭东

(1．中国科学院成都生物研究所，四川成都610041;

2．中国科学院大学，北京100049;

 3．中国科学院环境与应用微生物重点实验室，四川成都61004.1)

 摘要：为了研究生物硫铁应用于铜污染事故应急处理中保护鱼类免于死亡的可行性，以斑马鱼为受试对象，测定了铜对斑马鱼的各时间半致死浓度（LC岛），考察了投加量、投加时问、pH环境等条件对铜暴露巾斑马鱼死亡率的影响。结果表明：投加量越大斑马鱼死亡率越低，最佳投加量（硫化物与铜离子摩尔比）为I:l，此时斑马鱼96 h死亡率由对照组（不投加生物硫铁材料）的83%降低至OYo；在(24 h-/Cso) mg/L浓度下12 h内投加生物硫铁的斑马鱼死亡率都明{I^低于对照组，超过24 h则与对照基本一致；水体初始pH对生物硫铁的投加有影响，pH为8时生物硫铁对铜暴露斑马鱼的保护效果较好，在(48 h-LG，)mg/L浓度下pH 5投加组和pH 8投加组的斑马鱼96 h死亡率分别由ioo%和77%降低至50%和0%。研究表明，生物硫铁复合材料能快速降低水中铜离子浓度，从而保护鱼类免受毒害，其在铜污染事故应急处理中具有较好的应用前景。

 关键词：重金属污染；铜；斑马鱼；生物硫铁；保护作用

 近年来随着我国经济的发展，重金属污染事故频发，以铜为例，由于废水排量大和处理不妥引起的铜污染事故，如2010年位于福建上杭县的紫金山金铜矿因暴雨发生污水渗漏，事故造成汀江严重污染。铜是一种重要的有色金属，在纸浆纸板制造、木材及皮革保存以及石油冶炼等工业中广泛使用，其对大多水生生物体毒性较大，曾经造成沿海地区牡蛎受铜污染变绿，被我国列为严重污染环境和危害人体健康的优先控制污染物。因此对铜污染事故的应急处理显得尤为重要。

 目前在现行应急事故处理中，只要以碱沉淀为主。以2012年广西龙江镉污染事件为例，主要采用投加弱碱性烧碱沉淀镉形成氢氧化物，再通过聚氯化铝絮凝，使其沉淀到河底。但氢氧化物沉淀受水体pH值影响，pH降低会导致再悬浮沉积物重金属的释放，在龙江河污染事件处理中，龙江河中的含镉絮体会在模拟酸性洪水中释镉量大，稳定性差，对水生生态环境具有一定风险。

 近年来基于硫酸盐还原功能的微生物已成为处理重金属研究热点。硫酸盐还原菌可以生成硫化物沉淀重金属，形成稀酸不溶的金属硫化物沉淀，大大降低生物有效性，成为处理含重金属废水的生物修复方法之一。前期实验室选育出高产生物硫铁的菌株，其结合了微生物处理和物化处理重金属的优点，具有还原性强、比表面积大、不溶的硫化物二次污染的特点，对Cu2+、Cd2+、Pbz咯类重金属废水都有较好的去除效果。其粒径长为45～80 nm，长宽比10～15，其铁硫原子比为1.07～1.11，主要组分为无定形态硫化亚铁和四方硫铁矿。

 虽然关于硫酸盐还原菌去除重金属污染的研究很多，但主要集中在对含重金属废水和土壤中的应用，尚未见应用于水体中防止水生生物死亡的报道。本研究在此基础上，模拟受铜污染水体，以斑马鱼为对象，开展生物硫铁材料对铜暴露水体中斑马鱼死亡影响的研究，以期从死亡率变化初步得出生物硫铁材料的最适投加条件对斑马鱼的保护作用，为生物硫铁材料应用于铜污染事故水体提供科学依据。

1材料和方法

1.1材料

 仪器：pH酸度计(PSHJ-3F，上海精密科学仪器有限公司)，低速大容量离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂），原子吸收分光光度计（2-2300，HITACHI公司）

 试剂：硫酸铜，分析纯，产自天津市美琳工贸有限公司。

 实验用水：自然光照，水温(22±1)℃，pH为8.15～8.50，曝气24 h的除氯自来水，溶解氧>4.5 mg/L，水中未检出Cu2+。

 实验鱼：斑马鱼，购自成都青石桥花鸟市场，雌雄皆有，健康活泼，平均体长(30.25+3.12) mm，平均体重(0.31+0.05)g。在40 cmx23 cmx25 cm的玻璃缸内驯养7d，水温(22±1)℃，饲养密度为1 g/L（即每升水容纳斑马鱼的质量为1 g），每日光照14 h。驯养过程中每天定时喂食1次，并每天清除排泄物。实验前1d和实验期间不喂食。

 生物硫铁复合材料：生物硫铁材料生成菌——硫酸盐还原菌来自本课题组驯化后的纯菌株，将驯化后的菌株接种至改良Starkey培养基中，35℃培养箱中静置培养9～10 d即生成生物硫铁化合物，取培养物离心分离(5 000 r/min，10 min)，弃去上清液，用去离子水清洗1次，离心分离后的底部沉淀即为硫酸盐还原菌与纳米硫铁组成的生物硫铁复合材料，本实验以硫化物含量作为生物硫铁的有效含量。

1.2  方法

1.2.1  Cu2+对斑马鱼LCSo的确定

 实验鱼在中毒后鳃盖停止活动，用玻璃棒或小镊子轻轻刺激尾柄部分，仍无反应即可确定为个体死亡。

 在预实验基础上，设置Cu2+#/e度为0（对照）、0.15、0.25、0.375、0.5、0.75、1.0、1.5 mg/L，共8组，每缸中加4L实验用水，10尾鱼，每个浓度设置3个平行。采用静水式换水补药方法，每隔24 h全部换试液，使Cu2+保持初始，及时捞出死亡个体。分别于24、48、72，96 h观察并记录死亡情况，计算死亡率。

 数据用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用概率单位回归模型，根据Cu2+对斑马鱼的死亡率和死亡时间分析24、48、72、96 h的半致死浓度/C50和95%置信区间，安全浓度(safe concentration，SC)按照公式SC=96 h-/C50*0.1计算。作图数据以均值±标准差表示，用Excel作图。

1.2.2生物硫铁投加量对铜暴露斑马鱼的影响

 选取0.40 mgfL(48 h-/Ci，)Cu2曝露浓度，相同铜浓度下投加生物硫铁，硫化物与铜离子摩尔比分别为1：1、0.8:1、0.5:1、0.3:1。每组设置3个平行，4L水，10条鱼，采用半静水式换水补药加菌方法，24 h换1次试液。另作投加足量生物硫铁(硫化物与铜离子摩尔比为1:1)对照和只投加Cu2+X寸照，观察斑马鱼死亡率变化。

1.2.3生物硫铁投加时间对铜暴露斑马鱼的影响

 选取0.71 mg/L（24 h-/C50）作为Cu2+暴露浓度，分别在鱼暴露3、6、9、12、24 h时，投加足量生物硫铁（硫化物与铜离子摩尔比为1:1）。每组设置3个平行，4L水，10条鱼，采用半静水式换水补药加菌方法，24 h换1次试液。另作空白对照和只投加Cu2+对照，观察斑马鱼死亡率变化。

1.2.4水体pH对投加生物硫铁的铜暴露斑马鱼的影响

选取0.40 mg/L( 48 h-/Cso)作为Cu2+暴露浓度，采用盐酸和氢氧化钠调节pH值，分别调节为pH 5和8，再投加生物硫铁（硫化物与铜离子摩尔比为0.8:1）。每组设置3个平行，4L水，10条鱼，采用半静水式换水补药加菌方法，24 h换1次试液。另设空白对照和加Cu2调pH至5和8对照，观察斑马鱼死亡率变化。

1.2.5生物硫铁对铜暴露斑马鱼保护作用的机理探讨

 为了测定生物硫铁对Cu2+的降低效率，设置3个4L含1.0 mg/L的Cu2+溶液中，一个为只加Cu2+的空白，一个含Cu2+和10条鱼的对照，一个含Cu2+和10条鱼并投加足量生物硫铁(硫化物与铜离子摩尔比为1：1)，混匀搅拌后静置，分别在0、l、4、8、12、16、24 h取样，测其Cu2+浓度。

2结果与分析

2.1毒性实验

2 .1.1中毒症状

 随着实验时间的延长，敲击实验容器时，对照组实验鱼能迅速逃离躲避，而高浓度组实验鱼反应迟钝，没有及时进行有效躲避，表明Cu2+对斑马鱼的毒性明显抑制了斑马鱼的活动能力以及躲避天敌的能力与刘大胜等”州报道的较为一致。Cu2+为1.5 mg/L的高浓度时，8h后即开始出现斑马鱼死亡的现象，24 h死亡率达到100%，体表粘液分泌增多，鳃丝肿胀，鳃丝上附着有淡蓝色絮状物。可能是Cu2+与斑马鱼分泌的黏膜形成络合物，导致斑马鱼体表黏膜缺失并致死。

2.1.2 Cu2+对斑马鱼的/Cr,o

Cu2+对斑马鱼的96 h毒性实验结果如表1所示。随着Cu2+浓度的增大和作用时间的延长，斑马鱼死亡率增大，呈现明显的剂量一效应关系。由表1中得出Cu2+对斑马鱼24、48、72、96 h的/C50分别为0.71、0.40、0.30、0.23 mg/L，从而得出其安全浓度(1/10  /Ca，)为0.023 mg/L。这与宋志慧等的研究结果基本相似，但不同时间的/Ca，较宋志慧等研究结果略微偏低，这可能与所选斑马鱼鱼龄偏小有关。

2.2  生物硫铁复合材料的保护作用

2.2.1生物硫铁投加量对铜暴露斑马鱼的影响

生物硫铁不同投加量对斑马鱼死亡率影响见图1。在0.40 mg/L( 48 h-/Ca，)下，投加足量生物硫铁（硫化物与铜离子摩尔比为1:1）后，斑马鱼在24 h至96 h的死亡率都降低至0%，死亡率显著降低；当投加量分别为0.5:1、0.8:1时，斑马鱼96 h死亡率相较于对照组的分别从830/,降低至33%和7%。当投加量为0.3:1时，斑马鱼的中毒症状和死亡率均与对照组无明显差异，生物硫铁保护作用不明显。空白和只加生物硫铁的对照中，斑马鱼没有异常表现，实验中也没有出现死亡，说明生物硫铁材料对斑马鱼没有死亡影响：只加Cu2+组斑马鱼中毒症状和死亡率与毒性实验一致。由以上结果可见，铜暴露同时投加一定量的生物硫铁可有效降低斑马鱼死亡率，最佳投加量为（硫化物与铜离子摩尔比）1:1。这是因为生物硫铁跟铜离子主要发生Cu2++FeS—Fe2++CuS j反应，当硫化物与铜离子摩尔比为1:1时，体系中所有的铜离子都能与硫化物完全反应，能完全生成溶度积更小且稳定的CuS沉淀，达到沉淀Cu2+的目的。

2.2.2生物硫铁投加时间对铜暴露斑马鱼的影响

生物硫铁投加时间对斑马鱼的影响见图2。在0.71mg/L( 24 h-/Cr]，)下，斑马鱼暴露3h投加生物硫铁没有死亡。暴露6h投加其24 h死亡率为10%，96 h死亡率为17%；随着暴露时间的延长死亡率增加，在暴露9h投加生物硫铁24 h死亡率达到270h，96 h为330A；暴露12 h投加生物硫铁斑马鱼24 h死亡率达到37U/0且96 h为53%；暴露24 h投加生物硫铁的斑马鱼死亡率与对照组一致。暴露12 h内投加生物硫铁的死亡率都明显低于对照组，说明暴露一段时间后的斑马鱼再投加生物硫铁仍能使死亡率降低，而暴露24 h投加生物硫铁无效。由以上结果得出，生物硫铁投加时间越早死亡率越低，受铜污染后越早投加效果越好。重金属在鱼体内的吸收、清除始终处于动态平衡状态，当鱼体处于重金属污染严重的环境时，重金属在鱼体的蓄积占主导，一旦脱离则清除占主导。当投加生物硫铁后水中的铜离子浓度降低，对斑马鱼的毒害减小，得到降低死亡率的结果。所以在一定暴露时间内，铜暴露时间越短，受到毒害程度越小，生物硫铁投加后的死亡率就越低。因此可在重金属污染处加强监测和预警，为鱼类及时规避毒害响应争取时间。

2.2.3水体pH对投加生物硫铁的铜暴露斑马鱼的影响

  生物硫铁在pH=5和pH=8条件下投加的影响见图3。在0.40 mg/L( 48 h-/Ca，)下，对照组中pH=5条件下斑马鱼的死亡率在各个时间段中都明显高于在对照组pH=8条件下。而投加生物硫铁后，2种pH条件下的斑马鱼死亡率相对于对照组都明显下降，pH=5投加组和pH=8投加组的96 h的死亡率分别从100%和83%降低至50%和OoA，而投加生物硫铁后的pH=5组斑马鱼的死亡率同时段还是高于pH=8投加组。这是由于鱼对水体中铜的吸收主要通过鳃这条途径。悬浮颗粒物对水体中铜的生物有效性的影响，铜在吸收过程以溶解态摄入，而其它络合态铜不能被鱼鳃直接吸收。铜离子浓度越高，鱼对其吸收的速率越大。当水体pH=5时，水体中的Cu2+比pH=8时浓度更高，所以其死亡率明显高于在pH=8条件下。即使如此，相比于pH=5对照组，pH=5投加组仍使斑马鱼96 h死亡率从100%降低至60VO，显著降低死亡率，生物硫铁在pH=5环境中也能发挥一定保护作用。

2.3生物硫铁对铜暴露斑马鱼保护作用的机理探讨

在投加生物硫铁材料后自然静置24 h，1.0 mg/LCu2+降低情况如图4所示。如图可见，空白组中Cuz+仅略有下降，可能是其在水体中的自然损失所致；对照组中Cu2+与空白组无显著差异，表明鱼对水中Cu2+的自然减少无明显影响；实验组中Cu2+明显降低，24 h后浓度降低了860A。由此表明，生物硫铁材料对Cu2+有明显的降低作用，体系中除了Cu2+发生复分解反应生成CuS沉淀占主导地位¨2J，还有生物硫铁胞外聚合物EPS吸附途径，两者共同作用在吸附、沉淀铜离子中发挥重要功能。且降低率高、作用时间短，体现了生物硫铁的高效性。

3结论

 (1)生物硫铁材料对受铜污染的斑马鱼有保护作用。其最佳投加量为（硫化物与铜离子摩尔比）1:1，受铜污染后越早投加效果越好，最适投加环境为pH=8。

 (2)生物硫铁材料能高效的降低水中铜离子浓度，保护斑马鱼免于铜中毒。经自然沉降其24 h降低率可达到86%。