鸭血豆腐中甲醛测定超声前处理方法优化

 耿永然1，汪建明1，鲁绯2*

1．天津科技大学食品工程与生物技术学院（天津300457）；2．北京食品及酿酒产品质量监督检验一站(北京100075)

摘要采用响应面法(Responsesurface methology)优化超声波提取鸭血豆腐掺假甲醛的条件。在单因素试验的基础上，选取超声温度、超声时间、超声功率为影响因子，应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型，以回收率为响应值行分析。确定了最佳条件为：超声温度50℃、时间45 min、功率720 w。模型预测值为72.29%，验证值为71.23%,与预测值的相对误差为1.48%。超声提取鸭血豆腐中掺假的甲醛，结果表明具有简单快速、回收率高的优点，适用于鸭血豆腐中甲醛的提取测定。

  关键词响应面法；甲醛；超声提取

  甲醛是一种有毒物质，高浓度甲醛可能导致白血病。甲醛对细胞的巨大破坏作用，能使蛋白质变性，严重干扰人体细胞正常代谢。人一次误服10～20 μL甲醛溶液，即可导致死亡。2006年IARC专门发表了题为“IARC Monographs on the Evaluation ofCarcinogenic Risks to Human:  Volume 88 Formaldehyde”的文件，清楚的指出甲醛是人类A1类致癌物。近来有关鸭血豆腐使用甲醛浸泡的报道，使甲醛问题成为公共卫生关注的焦点。由甲醛引起的食品安全问题已被列入国家食品安全战略研究的重点。目前食品中甲醛含量测定，前处理方法主要采用的是蒸馏法，蒸馏法操作不易控制、费时费力，不适合大批样品的测定。超声处理作为一种新的前处理技术，在食品工业中有着广泛的应用。试验利用超高效液相色谱对鸭血豆腐中甲醛含量进行测定，利用Box_Behnken响应面法对鸭血豆腐掺假甲醛超声提取条件进行优化，建立了适合于鸭血豆腐中掺假甲醛的超声波提取前处理测定方法。

1  材料与方法

1.1主要试剂

 10 mg/m L甲醛标准溶液：中国计量科学院；乙腈：色谱纯，美国TEDIA公司；盐酸、氯化钠、2，4--硝基苯、磷酸氢二钠：北京中仪泰普有限公司；去离子水。

1.2主要仪器与设备

 J-069 Waters超高效液相色谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；XS105电子天平：瑞士梅特勒一托利多仪器有限公司；DJ-8D恒温水浴锅：常州诺基仪器有限公司；JP-2060超声波清洗机：洁盟超声设备有限公司。

1.3试验方法

1.3.1溶液配制

 盐酸一氯化钠溶液：2g氯化钠中加入6 m L浓盐酸定容至100 m L;磷酸氢二钠溶液：9g十二水和磷酸氢二钠溶于去离子水中，定容至50 mL;2，4-二硝基苯肼：20 mg的2，4--硝基苯肼中加入10 m L乙腈，乙腈定容10 m L。

1.3.2色谱测定条件

 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1mm×50 mm，1.8μm Column；检测器：紫外检测器；色谱系统：四元泵系统；波长365 nm；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：3斗L；流动相A为乙腈，流动相B为水。梯度洗脱：0～1.5 min，30%A；

1.5～1.7 min, 90% A; 1.7～3.5 min, 95% A; 3.6～5.0min．30% A。

1.3.3标准系列配制

 配制浓度分别为0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 mg/L浓度的甲醛溶液，将配制好的标准溶液中加入2 m L盐酸一氯化钠、1 m L磷酸氢二钠、0.5 m L衍生剂，加水定容至10 m L，反复摇匀，然后置于50℃恒温水浴锅中衍生40 min后，取出，冷却至室温，溶液经0.45μm 滤膜过滤，然后进行色谱分析。

 分别吸取配制的系列标准液，按对应的色谱条件上机测定，以甲醛质量浓度X1峰面积计算线性回归方程。线性相关系数为0.999 5，回归方程为回归方程：Y=217 846.5X+27 861.23，线性相关性良好，可用于外标法测定鸭血豆腐中甲醛的含量。

1.3.4样品前处理

 采取新鲜的鸭血，加入抗凝剂，并准确称取1 000g血液，加入标准品10 mg/m L标准甲醛1 m L，搅拌5 min，凝固后冷藏。称取100 g鸭血豆腐于烧杯中，捣碎，然后称取2.00 g（精确到0.01 g），加入20 m L盐酸一氯化钠，然后于5 000 r/min转速下离心3min，超声处理适当时间后，取2 m L上清液与10 m L比色管中，加入1 m L磷酸氢二钠，然后加入0.5 m L衍生剂，加水定容至10 m L，50℃恒温水浴40 min后，取出冷却至室温，然后取出，0.45 μm滤膜过滤，然后进行超高效液相色谱分析。样品含量的计算由公式(1)所示。

2结果与分析

2.1单因素对甲醛提取的影响

2.1.1超声温度对甲醛提取影响

 称取处理后鸭血豆腐3份，分别在30℃，40 ℃，50℃，60℃，70℃和80℃条件下，超声功率700W，超声40 min，进行超高效液相色谱测定，计算回收率。结果见图1。

 由图1可知，回收率随着超声温度的增加，呈现先上升再稳定再下降的趋势。随着温度的升高，甲醛衍生物提取率变高，甲醛回收率升高，当温度为50℃时，回收率为72.5%。之后随着温度升高，回收率下降。这可能是因为温度升高，导致氧化速率增大，使甲醛衍生物含量降低。同时考虑到温度过高，会加大超声波的空化效应和热效应，因此，选择40℃，50℃和60℃响应曲面法优化试验。

2.1.2超声时间对甲醛提取影响

  称取处理后鸭血豆腐3份，分别在20，30，40，50，60和70 min条件下，超声功率700 W，超温度50℃，进行超高效液相色谱测定，计算回收率。测定结果见图2。

 由图2可知，随着时间的增加，回收率先上升再下降的趋势。当时间40 min时，回收率为76.89%。40min之后，随着时间的延长，甲醛回收率降低。这可能是因为甲醛衍生物随着时间延长，在超声波的影响下，发生其他化学反应，导致含量降低，从而使甲醛回收率测定值降低。而且提取时间的增加会增加能耗。所以选择30，40和50 min进行响应面优化试验。

2.1.3超声功率对甲醛提取影响

称取处理后鸭血豆腐3份，分别在300，400，500，600，700，800和900 W条件下，超声时间40min，超声温度50℃，进行测定，计算回收率。结果见图3。

  从图3可以看出甲醛的回收率随着功率的升高，出现了先升高再趋于平缓的趋势。考虑到过大功率可能会影响物质的结构，加大超声波仪器的负担。因此选择600，700和800 W进行响应面优化试验。

2.2响应面法对超声提取条件优化

  单因素试验表明超声温度、超声时间与超声功率对甲醛的提取影响显著，在此基础上根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，采用3因素3水平的响应面分析方法设计试验，甲醛前处理超声参数进行优化。分析因素及水平见表1。

  不同超声方式对甲醛提取的影响见表2。以温度（X1）、时间（X2）和功率（X3）为自变量，回收率(Y)为响应值，采用Design-Expert 7.0对试验数据进行二次多项式回归分析，方差分析及显著性检验结果见表3。对各模型系数的p值进行分析，各因子经拟

如表3所示，二次响应面回归模型的F=4.66，p<0.01，说明该模型具有较高的显著性。失拟项p=0.774 4>0.05不显著，表明该模型具有较好的拟合程度。R2= 0.932 5，调整决定系数R2Adj=0.845 7，说明该方程回归效果显著，可以用来解释响应值的变化。

 图4~图6为各因素交互作用的响应面图，分别以温度、时间和功率取零水平时，其余2个因素对甲醛提取效果的影响。比较3个图可知，存在极值的条件应该在圆心处，超声温度（X1）和超声功率（X3）对甲醛提取的影响极为显著，表现为曲线较陡，这与回归分析的结果吻合。选用温度、时间和功率3个显著因素对甲醛提取回收率进行响应面优化调配参数试验。分析试验结果得到最适宜参数为温度50.75℃、时间45.04 min、功率717.66 W。回收率为72.29%。考虑到试验的实际情况，最终确定提取条件为温度50℃、时间45 min、功率720 W，采用此最佳条件进行验证试验，实际测得回收率为71.23%，与预测值的相对误差为1.48%。因此，采用此响应面法得到的提取条件参数可靠，具有一定的使用价值。

3结论

 采用超高效液相色谱测定鸭血豆腐中甲醛进行测定，在单因素试验的基础上，将响应面法应用于甲醛提取的工艺。回归分析结果表明，超声时间和超声功率的交互作用对甲醛回收率的影响比较显著。响应面分析结果表明，最佳工艺条件为超声温度50℃，时间为45 min，功率为720 W。回收率预测值为72.29%，验证值为71.23%，与预测值的相对误差为1.48%。因此，采用响应面法得到提取条件能够应用于鸭血豆腐中掺假甲醛的提取，为鸭血豆腐掺假甲醛提取前处理提供了一个更为简单的方式。