2，4-=硝基酚分光光度法测定山楂片中还原糖的研究

宋迪燊，何海艳，周玉，周丽红，陈培浩，杜军良

绵阳师范学院化学与化学工程学院(绵阳621000)

摘要  试验采用2，4-=硝基酚分光光度法测定山楂片中还原糖含量。确定了最佳测定条件：最佳波长：479nm．显色剂用量为2.2 mL,显色时间为7 min，显色温度为：94℃。同时，测得回归方程为：y=0.686 0x+0．174 0，R2=0.997，线性关系良好，在最佳条件下测定所购买的山楂片中还原糖的含量为36.59 mg/g，方法的检出限0.0013，回收率在93.6%—117.1%之间，相对标准偏差（n=6）≤6.3%、该法简便快捷，较适合于常规生产中测定山楂片还原糖含量。

关键词  山楂片；还原糖；2，4一二硝基酚分光光度法

 山楂为蔷薇科落叶灌木或小乔木山楂、山里红及野山楂干燥成熟果实果实含有丰富的营养物质，是“药食同用”的上等补品，在我国及欧洲已被广泛地用于医药及食品原料。现在药理学研究还发现山楂能帮助消化、促进脂肪分解，提高胃蛋白酶活性促进蛋白分解和吸收。具有降血压和抗心肌缺血作用。具有多种生理活性功能，如保护心血管系统、治疗心力衰竭及心绞痛、降低血压和总胆固醇、抗氧化等可通过抗氧化和清除氧自由基而具有抗癌、防

癌功效，多年来一直被誉为营养保健果品。但加工包装好的山楂片在储存和流通过程中，其所含有的还原糖，在有氨基化合物的条件下，可导致山楂片发生褐变，且随着时间的延长，褐变程度也加深。因此准确测定山楂片中的还原糖含量对于山楂片的保质及包装研究具有重要意义。目前用于测定山楂片中还原糖含量的方法主要有GB/T 5009.7-2008中规定的直接

滴定法和高锰酸钾滴定法，这两种方法操作较复杂，试剂繁多有腐蚀性，且易受人为因素干扰，此外，还原糖定量分析方法主要方法还有气相色谱或高效液相色谱。由于还原糖具有沸点高、不易挥发且不含生色基团等特点，使用气相检测需要将还原糖转化为挥发性衍生物，操作繁琐复杂。液相检测需要添加特殊设备如蒸发光检测器或衍生发色基团等，检测的灵敏度相对较低，所用的液相柱价格昂贵。分光光度法以其价格便宜，操作简单，消耗试剂少，准确性能达到分析要求，被广泛使用在还原糖的测定。最常见测定还原糖的分光光度法方法是3，5--硝基水杨酸法(DNS法)，而使用2，4--硝基酚分光光度测定还原糖的还少见报道。试验以2，4-=硝基酚为显色剂，用分光光度法测定山楂片中还原糖的含量。法操作简单、快速、准确性高、灵敏度高、费用低。法可为一些食品厂提供了一种测定食品中还原糖含量简单、迅速、准确的方法。

1  试剂和仪器

1.1仪器与设备

 T6新世纪紫外一可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；DB-2106B电热恒温鼓风干燥箱：成都兴天宇实验仪器有限公司；电子分析天平AUY120:上海精密科学仪器有限公司。

1.2材料与试剂

 2. 4-=硝基酚(DNP)(AR)、葡萄糖(AR)、氢氧化铜( AR)、酒石酸钾钠(AR)、氢氧化钠( AR)、亚硫酸钠(AR)、苯酚(AR)（均购于成都市科龙化工试剂厂）。

 山楂片：市售；试验用水均是二次蒸馏水。

2试验步骤

2.1  葡萄糖标准溶液的配制

 将无水葡萄糖烘干至恒重，精确称量0.250 0 g，用二次蒸馏水溶解，并定容至250 mL容量瓶中，配制成1.000 0 mg/mL的葡萄糖标准溶液以备用。

2.2  DNP显色剂溶液的配制

 准确称取2，4--硝基酚2.540 0 g，溶于250 mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入酒石酸钾钠91g，氢氧化钠10.5 g，苯酚2.5 g，亚硫酸钠2.5 g，搅拌至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至500 mL，贮于棕色瓶中备用。

2.3试验波长的确定

 准确吸取葡萄糖标准溶液和蒸馏水各4.00 mL，分别加入到25 mL比色管中，加入DNP显色剂2.0 mL，混合均匀后沸水浴加热5 min，迅速流水冷却，加水至25mL。先将葡萄糖标准液+蒸馏水（空白），DNP显色剂+蒸馏水（空白）用于基线校正，再将葡萄糖标准液+DNP显色剂（空白）试剂在波长为460—600 nm范围内进行扫描。

2.4显色剂用量的确定

 喟移液管准确吸取4.00 mL葡萄糖标准液加入到编号为1—8的25 mL比色管中，分别加入1，1.5，2，2.5，3，3.5和4 mL DNP显色剂，沸水浴加热5 min，流水冷却再定容，在波长470 nm下测定其吸光度。

 再一次用移液管准确吸4.00 mL葡萄糖标准液加入到编号为1～8的25 mL比色管中，分别加入1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4和2.6 mL DNP显色剂，沸水浴加热5 min，流水冷却再定容至25 mL，在波长470 nm下测定其吸光度。

2.5显色时间的确定

 分别吸取4.00 mL葡萄糖标准液加入到编号为1—8的25 mL比色管中，各加入2.2 mL DNP。并分别在沸水浴中加热3，4，5，6，7，8，9和10 min，流水冷却定容至25 mL，在470 nm波长下测定其吸光度。

2.6显色温度的确定

 分别吸取4.0 mL葡萄糖标准液加入到编号为1～8的25 mL比色管中，各加入2.2 mL DNP，并放入温度设定为65℃．70℃，75℃，80℃，85℃，90 0C，95℃和100℃的水浴锅内加热7 min，流水冷却定容至25 mL，在470 nm波长下测定其吸光度。

 再一次分别吸取4.00 mL葡萄糖标准液加入到编号为1—8的25 mL比色管中，各加入2.2 mL DNP，并放入温度设定为86℃，88℃，90℃，92℃，94℃，96℃，98℃和100℃的水浴锅内加热7 min，流水冷却定容至25 mL，在470 nm波长下测定其吸光度。

2.7葡萄糖标准曲线的绘制

 精确吸取葡萄糖标准液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00和1.20 mL分别置于25 mL的比色管中，均补水至2.0 mL，再加入DNP溶液2.2 mL，混合均匀后，94 0C水浴加热7 min，迅速流水冷却，加水至25 mL。在最佳条件下测定最佳波长为479 nm，空白调零，在479 nm波长下测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.8待测样品的提取

 将山楂片至于研钵中，充分捣碎混匀，烘干至恒重，称取12.500 0 g，加入与12.5 mL的水，用研钵研成泥状，再全部转移至烧杯中，加入煮沸冷却至80℃的蒸馏水，趁热过滤，收集滤液并定容至250 mL容量瓶中。

2.9样品的测定

 将样品稀释四倍后，准确吸取山楂片提取液0.60mL，在最佳条件下连续测定6批样品，根据标准曲线计算出还原糖的质量。

3结果与分析

3.1检测波长的选择

DNP法测定还原糖，即2，4--硝基酚在碱性条件下，与还原糖反应，生成物在煮沸条件下呈棕红色，并且在一定条件下，还原糖含量越多，颜色越深，吸光度越大。由图1可以看出最大吸光度的波长为470nm，通常情况下应该选择吸光度最大时的波长，即为470 nm。

3.2显色剂用量的确定

由图2可以看出，随着DNP试剂用量的增加，吸光度增大，当DNP用量在2.2—2.6 mL时，吸光度比较稳定，浮动较小。因此，为了减小DNP试剂对吸光度测定的影响，DNP试剂的用量不应该小于2.2 mL，故在试验中DNP试剂采用的是2.2 mL。

3.3显色时间的确定

由图3可以明显看出，在一定可见范围内，随着沸水浴时间的增长，吸光度增大。当沸水浴加热时间增加到7 min后，吸光度变化趋于稳定，说明显色反应基全部完成，故选择7min作为最佳显色反应时间。

3.4显色温度的确定

由图4可以明显看出，在一定的温度范围内，随着温度的上升，吸光度增大的趋势比较大。增大到一定的吸光度后，变化趋于稳定，故采用温度范围为90℃—100℃。

为了找到试验更精确的温度值，把温度的设定区间缩小，分别进行吸光度得测定，如图5所示，应选择最大吸光度时的温度，即94℃。

3.5标准曲线的绘制

从图6中可以看出，葡萄糖的含量和相应的吸光度数值之间有一定的线性关系，其线性回归方程为：y=0.686 0x+0.174 0，R2=0.997 0，线性关系良好。

3.6样品的测定

准确移取样品溶液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80, 1.00, 1.20和1.40 mL，分别置于25 mL比色管中，均补水至2.0 mL，再加入DNP溶液2.2 mL，混合均匀后，94℃水浴加热7min，迅速流水冷却，加水至25 mL。在最佳条件下测定最佳波长为479 nm，空白调零，在479 nm波长下测定吸光度，如图7。选择样品溶液为0.60 mL。

准确吸取样品溶液0.60 mL，在最佳条件下连续测定6批样品，结果见表1。根据标准曲线计算出还原糖的含量为0.457 4 mg/mL，即36.59 mg/g。

3.7方法的精密度和回收率

取3份空白样，按照添加的标准溶液与样品溶液质量比为0.8倍，1倍和1.2倍加入标准溶液，在这3个浓度水平下，每个水平分别测定6次，结果如表2。从表2得知平均回收率依次为：117.1%，96.88%和93.62%，相对标准偏差（n=6）依次为：0，5.5%和6.3%。测定结果的相对偏差较小，精密度较好，就可说明该方法可行。同时对空白样测定1 1次，RSD%为0.03，按照检测限=3×RSD/K，可得出该方法的检出限为：0.001 3。

4结论

试验以2，4--硝基酚为显色剂，用分光光度法测定山楂片中还原糖的含量。得出测定山楂片的最佳条件为：最佳波长：470 nm，显色剂用量为2.2 mL，显色时间为7 min，显色温度为：94 0C。同时，测得回归方程为：y=0.686 0x+0.174 0，R2=0.997，线性关系良好，在最佳条件下测定所购买的山楂片中还原糖的含量为36.59 mg/g，方法的检出限0.001 3，回收率在93.6%～117.1%之间，相对标准偏差(n=6)≤6.3%。为法操作简单、快速、准确性高、灵敏度高、费用低。法可为一些食品厂提供了一种测定食品中还原糖含星简单、迅速、准确的方法。

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