张协光，郑彦婕，曾泳艇，杨俊，杨国武
深圳市计量质量检测研究院（深圳518109）
摘要建立了食品中合成固醇类激素（群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、睾酮、司坦唑醇、甲基睾酮、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮和苯丙酸诺龙）和糖皮质类激素f泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、甲基泼尼松、倍氯米松和氟氢可的松）多残留的液相色谱一串联质谱(LC-MS/MS)检测方法。样品经乙酸铵提取，甲醇再提取，加水混匀，ENVI-Carb固相柱和NH3固相柱净化，经C18柱分离后进行LC-MS/MS选择反应监测模式下定量分析。合成固醇类激素采用正离子模式检测，糖皮质激素采用负离子模式检测，一次前处理，2次进样。19种激素的定量检出限为0.1～1.0μg/kg;采用1，3和10倍定量进行分析，回收率在50%～110%之间，相对标准偏差为2.0%~12.0%。对134批次样品进行检测，统计得到内源性激素（黄体酮、氢化可的松和睾酮）的本底值。
关键词合成固醇类激素；糖皮质激素；液相色谱-串联质谱；本底
激素可以调节机体代谢或生理功能，动物源食品中激素残留的检测常有报道。畜禽业以前常用激素促进动物的生长，由于多数激素类物质具有潜在致癌效应，长期摄人激素会导致人身体异常。我国农业部第235号公告已禁止使用甲基睾酮和群勃龙，而苯丙酸诺龙和丙酸睾酮也不得检出。许多国家和地区已禁止部分激素作为动物生长剂。
激素通过代谢残留于动物体内，其含量非常低，大部分在μg/kg水平，因此，需要高效率和高灵敏的检测方法。目前有关激素类兽药残留的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法和高分辨线性离子阱法等，分别应用于水、奶制品，肉制品和黄油等。高效液相法由于干扰严重，检出限高，而气相色谱-质谱联用法需要衍生，这两种方法已经慢慢少用；高分辨线性离子阱法由于设备昂贵，仍然难以大规模推广使用，现在主要的检测方法以高效液相色谱-串联质谱法为主。
试验采用超高效液相色谱-串联质谱法，固相萃取提取，应用于各种食品中，包括乳及乳制品、肉及肉制品、水产品、蛋及蛋制品等，其操作简单方便，适用范围广。采用此方法对134种样品进行测试，并对内源性物质进行（黄体酮、氢化可的松和睾酮）本底的调查，获得第一手的数据，运用于深圳市大学生运动会食品保障工作中，获得良好的经济社会效益。
1 材料与方法
1.1仪器与试剂
TSQ Vantage三重四极杆串联质谱仪：ThermoFisher Scientific公司；电喷雾电离源：ESI；Accela液相色谱系统：包括自动进样器；游涡振荡器：德国IKA公司；恒温振荡水浴摇床：德国IKA公司；全自动氮吹仪：美国Organomation公司。
甲酸、甲醇、乙腈：色谱纯，美国Merck公司；试验用纯水：制自Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；其它试剂：分析纯。
ENVI-Carb固相萃取柱(500 mg，6 m L)，使用前依次用6 m L（二氯甲烷-甲醇溶液7+3）、6 m L甲醇、6 m L水活化；NH3固相萃取柱(500 mg，6mL)，使用前用6 m L（二氯甲烷-甲醇溶液7+3）活化。
标准物质群勃龙、勃地龙、诺龙、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、司坦唑醇、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮、泼尼松、甲基泼尼松、地塞米松、倍他米松：德国Dr．Ehrenstorfer公司；苯丙酸诺龙：百灵威；泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、氟氢可的松：德国Sigma-Aldrich；所有标物纯度≥98%。
样品：市售。
数据统计分析方法：采用Matlab软件进行百分位数分析，输出中位值、75分位值及90分位值。中位值反映检出量的中等水平；75分位值反映检出量的较高端水平；90分位值反映检出量的高端水平。
1.2色谱／质谱条件
1.2.1色谱条件
色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18( 100 mm×2.1mm，1.9 μm)；柱温：30℃。进样量：10μL。合成固醇类激素：流动相A为0.1010甲酸水；B为乙腈；流速：0.3 m L/min。梯度洗脱：0.0 min 50% A;0.0～5.0 min 0～10% A; 5.0～8.0 min 10% A; 8.0～8.1 min10～50%A；8.1～10.0min 50%A。糖皮质激素类：流动相A为去离子水；B为乙腈；流速：0.2 m L/min。梯度洗脱：0．0min 70%A；0.0～4.0 min 70%～60% A;4.0～4.5 min 60% A; 4.5～5.0 min 60%~50% A; 5.0～6.0min 50% A; 6.1～8.0 min 70% A。
1.2.2质谱条件
合成固醇类激素：离子源：电喷雾离子源；检测方法：选择反应监测；扫描方式：正离子扫描；喷雾电压：3 000 V;加热气温度：400℃；鞘气(N2)压力：207 k Pa（即30 a rb）；辅助气(N2)流量：1.7 L／min（即5 a rb）；离子传输毛细管温度：350℃。
糖皮质激素类：扫描方式：负离子；喷雾电压：2 500 V；其余条件同正离子。选择反应监测(SRM)离子对见表1。
1.3样品处理条件
取样品5g，置于50 m L离心管中，加入10 m L 2.0 mol/L乙酸铵水溶液，旋涡混匀，加入25 m L甲醇振荡提取30 m L，离心，取上清液，加入75 m L去离子水混匀，待净化。
提取液以2～3 m L/min的速度上样于已活化好的ENVI-C arb固体萃取柱，上样完毕后，用1 m L甲醇淋洗，抽干3～5 min。然后将活化好的氨基柱串联接在ENVI-Carb固体萃取柱下方。用6 m L（二氯甲烷-甲醇溶液7+3）洗脱并收集洗脱液，再用2 m L（二氯甲烷-甲醇溶液7+3）洗脱氨基柱，合并洗脱液，用氮气吹干，残渣先用0.5 m L乙腈溶解后，再加0.5 m L水混匀，过0.22 μm的滤膜后上机。
2结果与分析
2.1液相色谱-串联质谱分析
合成固醇类激素和糖皮质激素在质谱检测中，合成固醇类激素采用正离子模式检测；糟皮质激素采用负离子模式检测。可一次进样实现正、负离子同时检测，但在实际检测中，甲酸对糖皮质激素有抑制作用，采用去离子水作为流动相后，糖皮质激素检出限可提高5～10倍。因此，试验采用同一前处理，2次进样。标准的选择离子色谱图如图1所示。
2.2样品提取与净化
试验采用了4种方法进行比较，样品称样量均为5g。方法1：加入10 g无水硫酸钠和20 m L乙酸乙酯萃取，HLB柱净化，适用于糖皮质激素残留检测，但是蛋和黄油经过处理后，油脂仍比较多；方法2：加入10%碳酸钠溶液3 m L和25 m L叔丁基甲醚提取2次后，离心旋干定容上机，该方法处理后合成固醇激素的回收率不理想，而且，样品基质比较脏，容易污染离子源，故不采纳；方法3：加入乙酸乙酯20 m L，萃取2次，漩涡5 min，摇床振荡30 min，合并两次萃取液，旋干后，加1 m L乙酸乙酯和正已烷5 m L，溶解残渣，过silica柱净化，该方法除油效果比较好，但是用硅胶柱要注意除水。潮湿的天气需加约1 cm厚的无水硫酸钠在硅胶填充料的上方；方法4：试验最后采用的方法，综合效果最为理想。
2.3样品定容溶液的选择
试验上机液采用0.5 m L乙腈溶解后，再加0.5 m L水混匀。试验初采用乙腈与水(5：5)定容时，发现部分激素回收率明显下降，并且重复性较差，改用乙腈溶解残渣后再用水定容，回收率明显上升。造成这种原因可能是因为部分激素属于油溶性，在乙腈在溶解度高，而在乙腈水混合液中，溶解度下降。
2.4分析方法的评价
2.4.1 方法的线性范围、检出限和定量限
由表2可知，采用外标法定量，回归方程的获得是利用浓度范围为1.00～100μg/kg的混合标准溶液，以浓度为横坐标（x，μg/kg）和定量离子对峰面积为纵坐标(y)进行线性回归计算，所得相关系数均大+0.999，线性关系良好，定量限(LOQ)根据信噪比S/N≥10确定。
2.4.2方法的回收率与精密度
用蛋、肉、奶和油四类样品采用加标测试回收率，采用1，3和10倍定量进行分析，回收率在50%～110%之间，相对标准偏差为2.0%～12%。虽然肉类回收率较低，但也能完全满足试验分析要求（见表3）。
采用该方法对134批次动物源性食品进行检测，外源性激素中有2批次检出地塞米松和2批次检出倍他米松，内源性激素（黄体酮、氢化可的松和睾酮）检出率较高。
2.5.1黄体酮检出情况分析
由表4可知，黄体酮在乳类及蛋类食品均为100%检出，且在蛋类和奶酪中检出水平较高。在乳类食品中，奶酪的黄体酮含量远高于其它食品，这可能跟奶酪在生产加工过程的浓缩效应有关。同样地，由于稀释作用含乳饮料料中黄体酮的检出水平则低于其它乳类食品。黄体酮在兽肉类食品中的检出率也较高，但检出平均水平低于乳类和蛋类。
2.5.2氢化可的松检出情况分析
由表5可知，氢化可的松主要在兽肉类食品和水产品中检出，乳类食品也有少量检出，且在兽肉类食品中的检出量高于水产品及乳类食品。
2.5.3睾酮检出情况分析
由表6可知，睾酮仅在蛋类和兽肉类食品中少量检出，乳及乳制品中有极少量检出。
3结论
建立了食品中19种激素的液相色谱一串联质谱( LC-MSIMS)检测方法，适合于蛋、肉、奶和油等样品。所建立方法前处理过程简单，净化效果好，有效降低了基质对激素检测的干扰，目标物回收率稳定。应用所建方法对134批次样品激素残留量的确证检测，得到内源性激素（黄体酮、氢化可的松和睾酮）在各类食品中的本底含量，所得数据投入到深圳市举办的第21届世界大学生运动会的食品保障工作中，具有一定的经济社会效益。
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