重组谷氨酸脱羧酶的分离纯化与酶学性质研究

   时粲，刘昭明*，黎娅，易弋，伍时华

  广西科技大学生物与化学工程学院（柳州545006）

摘要利用大肠杆菌原核表达系统获得高活力重组谷氨酸脱羧酶(GAD)并对其酶学性质进行分析。结果表明，纯酶比活力为9.9 U/mg;最适pH为4.6，最适温度为40℃，重组酶有良好的热稳定性，在70℃处理30 min仍有80%活性，在0℃保存一个月基本不失活；辅酶PLP及金属离子Fe2+. Ca2+. Mg2+. Cu2+对重组酶活力都有一定的促进作用，其中PLP最适浓度为0.005mol/L;吐温20作为非离子表面活性剂对重组GAD活力有促进作用，而阴离子表面活性

剂SDs对其活力有明显抑制作用；有机溶剂异戊醇对其活力有促进作用。重组GAD的Km=23.33 mm01，V max=1.133,μm01／(min. L)。  

关键词  重组酶；谷氨酸脱羧酶；酶学性质；y-氨基丁酸

    谷氨酸脱羧酶( GAD，EC 4.1.1.15)是广泛存在 于微生物、植物以及动物细胞中的一种高度专一性的磷酸毗哆醛类酶，通过催化不可逆a-脱羧反应使L~谷氨酸（钠）特异性地转化为y-氨基丁酸( GABA)，y-氨基丁酸( y-Aminnohutyric acid，GABA)是一种非蛋白氨基酸，作为哺乳动物中枢神经系统抑制性神经递质，在机体调节方面有诸多功能，如调节血压与心率、营养神经、治疗癫痫、辅助治疗哮喘、活化CA肾功能、促进生长激素分泌以及抗衰老等。随着GABA工业化应用研究的不断深入，具有安全性高、反应条件温和以及生产成本低等诸多特性的微生物合GA成为食品与制药行业新的发展趋势。已报道的GABA生产菌株主要有大肠杆菌（Escherichia coli、红曲霉（Monascus）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和乳酸菌（Lactobacillus）等。其中，杨帆等利用大肠杆菌作为生产菌株，全细胞转化法合成GABA,转化结束后，转化液中GABA的质量浓度高达60 g/L; Su等以红曲霉为生产菌株，采用固态发酵法产GABA，测得GABA产量达5 004 l-L9/9；Komatsuzaki等从传统发酵食物中筛选获得了一株乳酸菌（Lactobacillus paracasei NFRI 7415），经发酵培养获得发酵液中GABA质量浓度达33.1 g/L；但是，微生物体内GAD含量少，分离提纯损失较多，所以发酵法制备GABA在工业化生产中还有很大的弊端。因而，借助基因工程手段构建高拷贝重组质粒，高效表达并获得高活性的GAD可以大大提高GABA的生产效率。

    谷氨酸脱羧酶基因（gadB）来源于菌株LactobacillusplantaumQL-14，构建大肠杆菌表达菌株Escherichiacoli BL21-pGEX-4T-gadB，原核表达并纯化获得高活力GAD。通过对pH、温度等酶学性质进行研究，GABA定该酶作用的合适条件从而达到体外酶法制备GABA的目的。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

    工程菌Esche，ichia coli BL21-Pgex-4T-gadB，广西科技大学生物与化学工程学院发酵工程研究室保藏。   

 1.1.2试剂

    L-谷氨酸钠，市售；磷酸吡哆醛( PLP，BR)：美国AMRESCO公司；异丙基-β-D-巯基半乳糖苷( IPTG)：宝生物工程（大连）有限公司；氨苄青霉素钠( AMP)：SolarBio公司；y-氨基丁酸(含量≥99%，AR)：美国sigma公司；GST琼脂糖凝胶FF：北京韦氏博慧色谱科技有限公司。

    1.1.3仪器与设备

    MIKR0 220R 2205型低温冷冻离心机：德国HET- TICH; UV-1100型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；AB104-N型电子分析天平：美国双杰 兄弟有限公司；HWY-2112全温度恒温调速摇床柜：上海智城分析公司；恒温水浴锅：北京东方精瑞科技发展有限公司；JY600CDNA电泳仪：北京六一仪器厂。

    1.2方法

    1.2.1工程菌的活化及谷氨酸脱羧酶的获得

    取保存的工程菌活化于10 m L LB液体培养基（含100μg /m L AMP）37℃、12 000 r/min摇床过夜培养，取新鲜培养的重组菌菌液8.0 m L(含100μg/m LAMP)接种于800 m L LB液体培养基(含100μg/m LAMP)，37℃、12 000 r/min摇床培养至OD600=0.4～0.6时加入IPTG至终浓度1.0 m mol/L在16 ℃下过夜诱导。将诱导表达的菌液800 m L于6 000 r/min、4℃离心15min，收集菌体，用20 m L PBS缓冲液(pH 7.4)悬浮菌体，超声破碎细胞，然后经0.45μm滤膜过滤后上柱，用CST琼脂糖凝胶柱对重组蛋白进行纯化得到目的蛋白GAD。纯化后的蛋白经10%的SDS-PAGE蛋白电泳进行验证。以BSA（牛血清蛋白）为标准蛋白，采用Bradford法测定其浓度。

    1.2.2谷氨酸脱羧酶活力的测定

    采用Berthelot法。配制底物溶液Macllvaine缓冲体系（pH 4.8，含0.02 mol/L底物L-谷氨酸钠，0.01m mol/L辅酶PLP），取400 μL底物溶液和200μL酶液在37 ℃反应30 min，煮沸终止反应；再加入1.0 m L体积分数6%苯酚和1.0 m L次氯酸钠溶液，充分振荡后，沸水浴中反应10 min，迅速在冰浴中冷却显色20min，待出现蓝绿色后加入体积分数60%乙醇溶液2.0m L，最后在643.5 nm处测定吸光度。

  1.2.3谷氨酸脱羧酶酶学性质

  1.2.3.1  最适pH的确定及pH稳定性

    配制pH 3.6～6.0的底物反应缓冲液，37℃下将酶液分别与不同pH的反应液混合，测定GAD最适反应pH。再将一定量的酶液加入到以上不同pH的反应缓冲液中，37℃下分别保温2h，测定剩余酶活，考察GAD在不同pH条件下的稳定性。

1.2.3.2最适反应温度及温度稳定性

    采用pH 4.8的反应缓冲液，分别在20℃，25℃,30℃,35℃, 37 ℃, 40℃, 45 ℃. 50 ℃, 55℃,60℃，65℃和70℃下测定酶活，研究GAD的最适温度。将酶液置于以上不同温度下保温60，90, 120,150和180 min，测定剩余酶活，考察GAD在不同温度下的稳定性。

    将酶液储存于0 ℃保温一个月，每隔一周取出于最适条件下测定剩余酶活，考察GAD的低温条件下的稳定性。

  1.2.3.3辅酶浓度对酶活的影响

    采用37℃，pH 4.8的反应缓冲液，分别在辅酶浓度0, 0.005, 0.01, 0.015, 0.02, 0.03, 0.04和0.05m mol/L条件下测定酶活，研究辅酶浓度对酶活力的影响。

1.2.3.4不同金属离子及EDTA对酶活的影响

    在pH 4.8的反应液中分别加入终浓度为1m mol/L 的Ca2+,Mg2+, K+, Fe2+,Pb2+,Cu2+,Mn2+, Zn2+,Co2+,Al3+，Li+以及EDTA，37℃下测定GAD酶活，以不加金属离子的反应液作为对照组，研究不同金属离子及EDTA对其酶促反应的影响。

  1.2.3.5表面活性剂对酶活力的影响

    在pH 4.8的反应液中分别加入1%的表面活性剂吐温20、吐温80、SDS和聚乙烯醇，37 ℃下测定GAD酶活，以不加表面活性剂的反应液作对照组，研究不同的表面活性剂对酶活力的影响。

1.2.3.6有机溶剂对酶活力的影响

    在pH 4.8的反应液中分别加入1%的有机溶剂甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、异戊醇、丙三醇和正丁醇，37℃下测定GAD酶活，以不加有机溶剂的反应液作对照组，研究不同的表面活性剂对酶活力的影响。

1.2.3.7米氏常数的确定

    配制不同浓度的L-谷氨酸钠底物溶液分别与酶液在37 0c下反应30 min，同时将一定浓度的底物缓冲液与酶液在37℃反应不同时间并测定酶活，采用双倒数作图法确定GAD的K及V max值。

2结果与分析

2.1  重组酶的纯化及活力测定

    经IPTG诱导后的菌液经超声波破碎细胞，上清液即为粗酶液。用GST琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白并切除GST标签蛋白。纯化后的GAD经SDS-PAGE电泳分析，结果见图1，可看出经过纯化后得到相对单一的条带，表面已经得到较纯的GAD酶。纯化后酶液经测定蛋白含量为0.626 mg/m L。经测定纯化后的GAD比酶活达到9.9 U/mg。

2.2最适pH的确定及pH稳定性

    GAD在pH 3.6～6.0范围内反应时测定其酶活，由图2可见，最适pH为4.6，在pH 4.2～5.0范围内酶活都在50%以上；pH高于5.2时酶活力下降较为显著。pH稳定性方面，将GAD在pH 3.6～6.0不同pH条件下处理2h后测定酶活性，CAD在pH 4.0～4.8范围内保温2h后均能保持80%以上的酶活力；pH大于5.0，酶活降低较为明显，说明该GAD在酸性环境下相对稳定，具有较高的酸依赖性。

2.3最适反应温度及温度稳定性

    在20℃～70℃范围内进行GAD酶促反应，测得的酶活结果见图3。由图3 (A)可知该GAD在20℃～40℃范围内，随着温度的升高，酶活上升趋势明显，40℃时酶活性达到最高；在40℃～70℃随着温度升高，酶活则呈下降趋势，下降幅度不大，并且在70℃还有80%活性。热稳定性试验结果如图3(B)所示，GAD在20℃～40℃较稳定，水浴保温2h后相对酶活仍在

85%以上，说明该酶在此温度范围内具有较高的稳定性，随着温度的升高，酶稳定性逐渐下降，到达55℃时水浴保温1h，酶活急速下降。

    在低温稳定性方面从图4可以知道，该酶在0℃时有良好的稳定性，并且将酶置于0℃环境下，1～5周酶活基本上没有丧失。

2.4辅酶浓度对酶活的影响

    GAD是磷酸吡哆醛类酶，GAD在生物体内以PLP为辅酶进行催化反应。试验研究辅酶PLP的浓度对重组GAD的活力的影响，图5可以看出，低浓度的辅酶PLP对重组GAD活力有一定促进作用，随着辅酶浓度的增加重组GAD的活力提高不明显，而脱辅基GAD仍有一定的活力。

2.5不同金属离子及EDTA对酶活的影响    

金属离子与辅酶一样可以影响生物体内不同酶的催化作用，经常作为促进或者抑制酶反应的辅助因子。因此在酶促反应中经常添加某些金属离子来改善酶促反应的进行。在重组GAD酶促反应中添加各种金属离子以及EDTA来考察不同金属离子对重组CAD酶促反应的影响，见图6。可以看出Zn2+、Li+.Pb2+和EDTA均对重组GAD的活力有较大的抑制作用，Mri2+、Al3+和CO2+等对活性影响不明显，Fe2+、Ca2+.Mg2+和Cu2+对该酶有较强的激活作用。

2.6表面活性剂对酶活力的影响

    表面活性作为一种能够影响酶溶液表面张力的物质往往用于改善酶促反应。试验中，以不加表面活性剂的对照组，活力最高的设为100%，以加入1%的不同的表面活性剂吐温20、吐温80、SDS和聚乙烯醇为试验组，探究其对重组GAD活力的影响。如图7所示，吐温20和吐温80对GAD活力均有不同程度的促进作用，分别提高55%和42%符合非离子表面活性剂作为乳化剂促进酶促反应的一般规律，而SDS和聚乙烯醇对GAD活力有不同程度的抑制作用，其中SDS对重组GAD抑制作用最大。

2.7有机溶剂对酶活力的影响

    有机溶剂不仅可以改变酶催化反应的平衡点使其在水溶液中不能或者很难发生的反应向着期望的方向进行，还可以调节包括区域专一性和对映体专一性在内的底物专一性，从而使酶的催化调节成为可能。为此，试验通过在酶反应中加入一定量的不同有机溶剂，以不加有机溶剂的对照组，设酶活力最高的为100%，研究不同有机溶剂对GAD酶活力的影响。如

图8可以看出甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、丙三醇和正丁醇对GAD活力均有抑制作用，异戊醇对其活力有促进作用。说明大部分有机溶剂对水相中的酶活力作用不大，但是部分有机溶剂可以成为酶活力调节的促进剂。

2.8米氏常数的确定

    通过测定不同底物浓度下的酶活力，按照米氏方程，得出1/[S]与1/V的关系，并用Lineweave，-burk作图法，求出重组GAD的米氏常数，见图9，可得Km=23.33 m mol/L,  V max=1.133μ mol/( min. L)。

3结论与讨论

    利用基因工程手段获取谷氨酸脱羧酶( GAD) -直是近几年的研究热点。试验中的GAD最适反应pH为4.6，并且在最适pH 4.0～4.8有较高活性，与已报道的微生物来源的GAD反应最适pH在4.0～6.0之间基本一致。不同来源GAD温度的稳定性不尽相同，孪云等分离的片球菌（Pediococcus）中GAD在60℃时相对酶活力仅35.30%, Fan E等克隆的短乳杆菌（Lactobacillus brevis CGMCC 1306）在70℃相对活性仅有10%，而试验中重组GAD在70 ℃反应条件下处理30 min仍有80%，50℃处理2 h仍有50%以上活性体现出较高的温度耐受性。0 ℃热稳定性分析结果也从侧面反映出该GAD良好的热稳定性。通过测定一定温度下酶反应的动力学常数并符合米氏方程得出重组GAD的米氏常数Km=23.33 m mol/L，Vmax=1.133μmol/( min．L)。

    由于GAD是磷酸吡哆醛(PLP)类酶，辅基PLP理论上对酶的活力及酶的活性会有所影响，试验发现辅酶PLP的最适添加量为0.005 m mol/L，GAD活力提高14%，与报道的PLP对脱辅基GAD活性影响不大结果基本一致。在影响酶活性的另一个方面金属离子中，发现Mg2+对该酶有较强的激活作用与报道较为一致，而Ca2+对GAD的促进作用类似于植物中Ca2+通过形成钙调蛋白黏合区域( Ca M)影响GAD的作用原理。但是Fe2+和Cu2+对该酶也有激活作用，与报道中Fe2+、Cu2+对微生物体内GAD活性有较强抑制作用的结论截然相反，而得到了与试验相同的结论Cu2+对重组GAD活性有促进作用，说明重组GAD与天然GAD特性有较大差别。Zn2+、Li+以及EDTA对GAD酶活性有部分抑制作用。

    非离子表面活性剂如吐温（聚山梨酯）等对酶活影响较小，甚至有激活作用；阴离子表面活性剂对酶活力影响较大，主要起抑制作用。试验通过研究四种表面活性剂对重组GAD活性的影响发现，吐温20对酶活力促进作用最大这是因为吐温作为表面活性剂在反应体系中起乳化作用在一定浓度下是底物与酶充分接触有利用酶促反应，而SDS对其较强抑制作用，

则可以认为是SDS作为离子型表面活性剂通过静电作用使酶的构象发生变化从而导致酶活力下降。有机溶剂通过夺去蛋白表面水分子造成酶分子内部疏水基团暴露从而改变反应过程中的界面效应，大部分有机溶剂对GAD酶活力有抑制作用，而异戊醇对GAD促进作用也是由于异戊醇的乳化作用。

    通过对重组GAD特性及体外转化GABA条件进行探究为GABA的工业化生产提供了必要的参考依据。