吕文杰，王洪涛，黄芳，王健，王芃，洪鎏，周建光，潘耀振，李山虎
1．贵州医科大学，贵州贵阳550001；2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850
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[摘要]目的：构建SCK3激酶PX结构域突变体载体，观察其在人肾胚细胞293T中的表达与定位。方法：利用重叠延伸PCR原则设计引物，合成具有点突变的SGK3突变体，将其连接到pEGFP载体上，测序验证；将所获突变载体瞬时转染人肾胚细胞293T，利用荧光倒置显微镜检验突变体在细胞中的表达及功能实现。结果：测序结果表明合成了具有点突变的SGK3序列；荧光倒置显微镜下SGK3突变体相较野生型SGK3在293T细胞内的不均匀分布表明转染成功，突变体载体在人肾胚细胞293T中获得表达且有所定位。结论：通过改变PX结构域序列上第90位氨基酸可以使SGK3激酶失去定位的功能，从而为研究SGK3在细胞中的功能提供基础。
[关键词]SGK3激酶；重叠延伸PCR；PX结构域
SGK3是属于AGC蛋白家族的激酶。SGK家族有3个同分异构体SGKI、SGK2和SGK3，它们与AKT家族分子的催化域拥有近55%的相同序列。SGK3受转录及转录后磷酸化修饰，在PI3K下游作为连接生长因子、胰岛素、营养物等与细胞生长、增殖、代谢、生存的一条重要途径。近年来随着研究的进展，SGK3在乳腺癌、前列腺癌、肝癌细胞中的重要作用逐渐受到重视。
已知SGK3的分子结构包括3个主要的功能区域，即位于N端的PX( Phox)结构域、中间的催化结构域和C端的疏水域。PX结构域对磷脂酰肌醇( PIP)特别是PI(3)P有很强的亲和力，可以使含有这种结构的分子特别是信号分子定位在富含这类分子的细胞内膜结构的表面，特别是初级内体(early en-dosome)上，受上游刺激后在细胞内传递信号。我们拟构建点突变PX域的SGK3质粒，再使其转染293T细胞后表达，并用免疫荧光显微镜观察其在细胞中的定位，为SGK3后续的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
人肾胚细胞293T、pEGFP载体为本实验室保存；T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH I与Xho I购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒及Vigofect转染试剂购自Vigorous公司；ULybrene购自Santa Cruz公司；嘌呤霉素购白Sigma公司；山羊抗小鼠、山羊抗兔、兔抗山羊抗体购自中杉金桥公司。
1.2引物合成
参考GenBank中的SGK3序列，根据文献设计SGK3引物及PX结构域突变位点（具体见结果部分及其图示），由北京天一辉远公司合成。见表1。
1.3单重PCR反应
以实验室现有野生型SGK3质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物为重叠延伸PCR所需的A、B片段。A片段PCR反应体系：SGK3模板0.51 uL，引物1 1uL，突变引物B 1uL，dNTP l uL L，iox缓冲液2uL，Pfu高保真酶0.5uL，ddH：0 14 111，共20 uL。B片段PCR反应体系：SGK3模板0.5 uL，引物2 1uL，突变引物A 1uL，dNTP l uL，10X缓冲液2uL，Pfu高保真酶0.5 uL，ddH：0 14 uL，共20 uL。PCR反应条件：预热94。C3 min，解链95℃30 s．退火55℃30 s，延伸70cCl min，30次循环。反应结束后用2%琼脂糖凝胶电泳检测2组扩增片段，分别切下含有目的片段的胶条，用胶回收试剂盒回收，获得用于重叠延伸PCR的DNA片段。
1.4重叠延伸PCR反应
分别取上述扩增的A、B片段进行重叠延伸PCR反应。反应体系：模板为A、B片段各1uL，引物1（A片段）1 uL，引物2（B片段）1UL，dNTP l uL，10X缓冲液2uL，Pfu高保真酶0.5uL，ddH：0 13.5uL，共20I uL。PCR反应条件：预热94qC3 min，解链95℃30 s，退火55℃30 s，延伸70。C2 min，32次循环。所得PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测回收。
1.5 构建pEGFP-SGK3突变体
将PCR回收产物与pEGFP载体分别用BamHI /Xho I双酶切过夜（pEGFP载体500 Vg或PCR回收产物30 uL，10×缓冲液1.75 UL，BamH 1 0.3uL，Xh0 1 0.3 uL，lOOxBSA 0.35 uL，加水至35uL），之后用1.5%琼脂糖凝胶鉴定并回收酶切产物，用T4 DNA连接酶连接过夜（酶切产物15 uL，连接酶缓冲液2 uL．载体1uL，连接酶0.3uL，水1.7uL)，测序。
1.6瞬时转染和细胞培养
从液氮储罐中取出人肾胚细胞293T，快速复温，离心去除冻存液，用含10% FCS的DMEM在37。C、5% CO2条件下培养，2—3 d传代，待细胞生长至60%可开始瞬时转染，转染前须更换新鲜的细胞培养液。在超净台下取质粒pEGFP-SGK3-R90A及pEGFP-SGK3- WT（作为对照）各1ug，分别加入70uL DMEM;再取3份转染试剂PEI各1uL，分别加入70uL DMEM中；轻轻混匀各管中试剂，静置5 min；再分别将质粒溶液缓慢加入转染试剂PEI溶液中，轻轻混匀后静置20 min；取质粒、转染试剂混匀溶液，缓慢滴人细胞培养皿中，摇匀后放入细胞培养箱中，12 h后更换新鲜培养液。
2结果
2.1 突变体的设计
图1为SGK3的结构简化图。我们在NCBI的GenBank中查找出SGK3的mRNA序列，找到其PX结构域中第90位氨基酸的3个碱基对，将其中精氨酸(R)的碱基序列AGA替换为丙氨酸(A)的GCC，再按照引物设计原则扩选选取上下游方向各约10bp的碱基对作为突变引物。按照PCR原理，分别以SGK3引物和突变引物两两配对合成带有可配对的重叠序列的SGK3突变体A、B片段，再用PCR技术将带重叠序列的A、B片段构造成一个完整的SGK3突变体（图2）。
2.2 突变基因的克隆与鉴定
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图3，单重PCR扩增出R90A的上游序列约300 bp、下游序列约1000 bp，重叠延伸PCR反应后SGK3-R90A约1500 bp，结果与预期大小相同。重叠延伸PCR产物同对照的野生型SGK3片段经琼脂糖凝胶电泳对比鉴定大小均相同（图4）。将构建的质粒送北京天一辉远公司测序，结果用Chromosome软件对比分析，如图5，表明成功构建了SGK3片段中R90A点突变位点。
2.3 SGK3激酶PX结构域突变体的细胞定位检测
将转染细胞培养48 h后在荧光倒置显微镜下观察细胞内SGK3PX结构域突变体及对照pEGFP-SGK3的分布，如图6，可以发现转染pEGFP-SGK3-R90A的细胞中绿色荧光物质分布均匀，而pEGFP-SGK3细胞中绿色荧光在细胞内局部增强，表明突变后的SGK3无法在细胞内定位，而野生型的SGK3分子可以定位聚集在胞内特定部位。
3讨论
基因突变技术是生物学研究中重要的技术之一，通过有目的地改变目标DNA序列的碱基，为研究基因的表达，特别是蛋白质的结构与功能的关系提供基础。重叠延伸PCR技术由Horton在1989年建立，是利用PCR技术的原理和特点，采用具有互补末端的引物扩增目的片段，使PCR产物形成具有互补重叠链的DNA片段，在第二次扩增反应中通过DNA链重叠部分的延伸，将2段不同的扩增片段拼接起来。与传统方法相比，重叠延伸PCR定点诱变几乎可以在DNA模板上的任何位点引入突变，过程快捷、简便、成本低廉，无须借助其他试剂或技术。目前重叠延伸PCR定点诱变技术已成为DNA靶片段产生突变的常用方法。
PX结构域首先发现于NADPH氧化酶复合物的p40”““和p47”“…亚基中。PX结构域通常包含100～140个氨基酸残基，有着特定的保守的空间结构。它存在于100多种真核细胞蛋白中，参与膜运输生理过程。细胞膜和胞内细胞器膜中都有特异性的磷脂，磷脂酰肌醇是其中之一，参与多种生理过程。PIP有7种，分别为PI(3)P、Pl,，，P、Pls)P、PI13.41P2、PIc351P.、PI14.11P2和PI(l;.4.f，P3。其中，Plc3)P主要分布于初级内体，PI,3.5，P：主要分布于次级内体(late endosome)和溶酶体，Pl．。，P、PI4.51P：和PIii，，B主要分布于细胞膜l…。Tessier等用蛋白脂质覆盖试验证实SGK3的PX结构域对PI．，IP具有高度亲和性，可以与其结合，同时也能少量地与Pl c。，P、PIisiP、PI3.4)P.和PI175)P.结合l6 1，这说明SGK3可以通过它的PX结构域主要结合在胞内的初级内体上。实验中我们针对PX域中第90位氨基酸，这是一个处于磷酸肌醇头部的与磷脂的潜在结合位点，利用重叠延伸PCR技术使用丙氨酸将其精氨酸替换，SGK3分子中的PX结构域就无法行使其结合磷脂酰肌醇的功能，从而使得SGK3在细胞中无法定位（在初级内体中）。SGK3 PX结构域点突变的构建与表达，为进一步探索SGK3的分子功能、解释SGK3的分子作用机制提供了有力证据。
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