鹦鹉热衣原体的B598_0590基因编码包涵体膜蛋白

李鹏，何君，朱虹，李岩伟，于永慧，端青，宋立华

1．病原微生物生物安全国家重点实验室，军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100071；

2．解放军第264医院，山西太原030001

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[摘要]目的：鹦鹉热衣原体的B598_0590基因与沙眼衣原体的毒力基因CT135同源，本研究旨在分析该基因的表达和定位。方法：生物信息学方法分析B598_0590基因的进化地位，比较B598_0590蛋白和沙眼衣原体毒力蛋白crr13s的氨基酸疏水特征；重组表达、纯化鹉热衣原体的B598_0590蛋白，免疫小鼠制备抗血清；共聚焦免疫荧光观察鹦鹉衣原体在正常培养条件和使用LpxC抑制剂时B598_0590基因的表达和定位。结果：衣原体属内12个种的基因组均含有CT135同源基因，它们编码的蛋白质有相似的疏水特征；B598_0590与CT135的氨基酸同源性为21%；B598_0590的免疫荧光染色特征与包涵体膜蛋白IncA相似，浓染包涵体膜; LpxC抑制剂可抑制网状体的分裂、包涵体的生长及网状体向原体转化，包涵体膜蛋白的染色呈现典型的空泡结构。结论：LpxC抑制剂可用于鉴定未知的鹦鹉热衣原体包涵体膜蛋白；鹦鹉热衣原体的B598_0590基因编码此前尚未鉴定的包涵体膜蛋白。

[关键词]鹦鹉热衣原体；包涵体膜蛋白；蛋白定位；CT135；B598_0590

 鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci，简称Cps）是一种专性细胞内寄生的人兽共患病原菌，归类于衣原体目、衣原体科、衣原体属。Cps广泛感染动物，主要导致流产、关节炎等，感染人可引起非典型肺炎等疾病。Cps在独特的包涵体囊泡内增殖，有原体和网状体2种结构形式，分别为感染相和繁殖相。由于易通过气溶胶一呼吸道传播和高致病性，Cps被列为生物战剂和生物恐怖剂。

 本研究的对象是Cps B598_0590基因——沙眼衣原体（C.trachomatis，简称Ct）的CT135同源基因。在雌鼠生殖道感染模型上，CT135是新发现的功能未知的毒力因子，与Ct D型菌株的感染持续时间和导致输卵管组织增厚等炎症病理反应相关。该基因在未经体外培养的临床样本中保持完整，但在细胞培养系统中易发生无义或移码突变，是目前发现的惟一的衣原体不稳定基因，与Ct的体外适应性生长有关。

 目前CT135及其同源基因是否编码蛋白质、蛋白质的表达和定位都还不清楚。我们分析了衣原体属内12个种的CT135同源蛋白的系统进化关系和疏水特征，通过重组表达Cps的B598_0590、主要外膜蛋白MOMP和包涵体膜蛋白IncA，并制备相应抗血清，利用共聚焦免疫荧光分析了B598_0590基因在正常培养条件和使用LpxC抑制剂时的表达和定位，为下一步深入研究CT135及其同源基因的致病机制奠定了基础。

1  材料和方法

1.1材料

 HeLa229细胞、Cps菌株CG1、pGEX4T-l原核表达载体由本室保存；大肠杆菌BL21感受态细胞、DNA提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自博迈德公司；限制性内切酶、T。DNA连接酶、质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司；荧光二抗488、DAPI购自Life Tech-nology公司；Q5 DNA聚合酶购白NEB公司；引物由上海生工公司合成。

1.2  生物信息学分析衣原体属CT135同源基因

 使用NCBI数据库，通过蛋白序列同源性比对，发现GenBank中衣原体属所有12个衣原体种CT135同源基因的基因号，利用Geneious软件对CT135同源蛋白进行同源性分析，绘制同源关系进化树；使用DNASTAR软件分析B598_0590和CT135蛋白的疏水特征。

1.3  蛋白表达纯化

 以Cps CG1株基因组为模板，采用引物对(F:TCCCCCGGGTGAGGCGGAGTCCGCTTTTG; R: CCCTCGACrTATTGCCCTGAACGGATCGC)和Q5 DNA聚合酶扩增B598_0590基因；PCR产物经Sma I和Xho I酶切后，与经同样酶切处理的载体pGEX4T-l连接，转化大肠杆菌BL21；工程菌培养至D600n。、为0.8，加入1  mmol/L IPTG诱导1、2和3h时取样，分析蛋白的表达；取诱导2h的L程菌，超声波裂解后收集包涵体蛋白，用PBS、2 mol/L尿素和纯水分别洗涤3次；将洗涤后的包涵体蛋白用PBS重悬，超声波3h后置-30℃备用。

1.4免疫动物制备抗体

 取重组包涵体蛋白50 ug与等体积的完全弗氏佐剂乳化后，行小鼠腹腔注射；初次免疫后的第14d，用50ug重组蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂乳化后进行第2次免疫；第2次免疫后7d，用50ug重组蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂乳化后进行第3加强免疫；第3次免疫后1周，小鼠眼球摘除取血，分离抗血清。

1.5激光共聚焦免疫荧光观察蛋白定位

 用Cp.s CG1感染HeLa229细胞，培养基为含有1 ug/mL放线菌酮和10%胎牛血清的DMEM，或加入1 ug/mL LPC-OI1（LpxC抑制剂lsl），感染30 h后甲醇同定，以1：100稀释的抗血清为一抗、1：800稀释的荧光二抗488进行免疫染色，以主要外膜蛋白MOMP和包涵体膜蛋白IncA为对照，激光共聚焦显微镜观察结果。

2结果

2.1  生物信息学分析衣原体属CT135同源基因

通过氨基酸序列比对，发现衣原体属内的12个种一致存在CT135同源基因，它们的蛋白质进化关系见图1A，与基于16S rDNA的进化树很相似，说明CT135同源基因是衣原体属的保守基因。CT135与B598_0590蛋白的同源性不高，只有21%，但二者具有相似的疏水特征（图1B），特别是CT135同源蛋白一致含有约60个氨基酸残基组成的2个连续的疏水裂片（图1B框区），这是衣原体包涵体膜蛋白的一个特征。因此，生物信息学分析提示CT135同源基因可能编码保守的包涵体膜蛋白。

2.2  8598_0590蛋白的表达与纯化

PCR扩增出的目的片段经酶切、连接载体后，转化大肠杆菌BL21构建原核表达菌株，菌株于37。C经IPTG诱导表达，分别于1、2和3h取样，全菌SDS-PAGE分析，相对蛋白分子质量约59xl03处有明显的蛋白条带，与预期一致，且在诱导2h时表达量最高；超声波破菌后分析，目的蛋白以包涵体的形式大量表达，随后经梯度离心和洗涤，获得了较纯的包涵体蛋白（图2）。

2.3  共聚焦免疫荧光证实B598_0590基因编码包涵体膜蛋白

正常培养条件下感染后30 h（图3A、B、C），Cps进入发育周期的中后期，包涵体发育成熟，其形状不规则，充满了衣原体颗粒；菌体主要外膜蛋白MOMP和包涵体膜蛋白IncA有显著不同的免疫荧光染色特征，这是因为MOMP和IncA分别分布在菌体外膜和包涵体膜上；B598_0590的染色特征与IncA有相似之处，可以浓染包涵体膜，但二者也有显著差异。IncA抗体均一地只染色包涵体膜，而B598_0590抗体在个别包涵体中可以只浓染包涵体膜，多数情况下浓染包涵体膜和在包涵体内部着色。这说明B598_0590编码包涵体膜蛋白，但其表达和分泌与IncA有差异。

 在培养基中加入LpxC抑制剂时（图3D、E、F），Cps的类脂A合成途径被抑制，原体转化为体积巨大的网状体，网状体仅可进行有限次数的分裂，包涵体的生长及网状体向原体的转化也被抑制，可观察到MOMP分布在菌体内部，说明MOMP不能正常分泌表达；IncA可部分地正常分泌表达，其抗体的免疫荧光染色呈现典型的空泡结构；B598_0590抗体的免疫荧光可观察到类似IncA的空泡结构。以上说明在有LpxC抑制剂时，包涵体膜蛋白至少可以部分地正常表达分泌，再次证实了B598_0590编码包涵体膜蛋白。

3讨论

 传统的衣原体包涵体膜蛋白鉴定都是在正常培养条件下进行的，该方法的一个问题是很多包涵体膜蛋白不是均一地在包涵体膜上分布，有时在包涵体内部或菌体表面也有分布，这给判断蛋白质是否分泌到包涵体膜上带来了干扰，B598_0590即是一个例子。本研究测试了LpxC抑制剂对Cps生长发育的影响，发现LpxC抑制剂可抑制网状体的分裂和包涵体的生长。LpxC抑制剂干扰了MOMP的分泌，可能也会影响Ⅲ型分泌系统的组装，但不影响已有的Ⅲ型分泌系统发挥功能。由于包涵体膜蛋白是Ⅲ型分泌系统的底物及包涵体中的菌体数量有限，包涵体膜蛋白的免疫荧光可观察到典型的包涵体空泡结构，这为鉴定Cps的包涵体膜蛋白提供了一种易观察的方法。另外，据国外报道LpxC抑制剂不影响Ct的包涵体生长和菌体分裂，显然LPS对不同衣原体种的生长发育有不同的作用。

 衣原体的包涵体是宿主与菌体的中介，包涵体膜蛋白无疑是重要的毒力因子。但不同衣原体种的包涵体膜蛋白种类变化较大，这可能与衣原体不同的宿主和组织嗜性相关。我们发现B598_0590或CT135的同源基因是衣原体属特异，并通过2种方法一致鉴定B598_0590基因编码包涵体膜蛋白，这使得衣原体属特异性的包涵体膜蛋白种类又增加了一个。我们发现B598_0590蛋白的定位与IncA有差异，前者在包涵体内部也有分布，说明B598_0590可能预装在菌体表面并在感染早期发挥作用。作为一个新发现的毒力因子，CT135在衣原体的体外适应性生长和延长体内的感染时问中发挥了重要作用，但相关机制还不清楚。本研究为下一步深入探讨B598_0590或CT135同源基因的功能奠定了基础。