腺病毒55型在A549细胞中的增殖动力学特征

张绮玲，李庆军，王鑫，曲新艳，杨全，杨静

1．广东药学院中药学院，广东广州，510006;

2．军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850;

3．河南中医药大学药学院，郑州河南450008

[摘要]目的：利用噬斑法研究人呼吸道腺病毒55型( HAdV-B55)在A549细胞中的增殖动力学特征。方法：以正交法得出HAdV-B55的最佳噬斑条件；HAdV-B55以感染复数(MOI)为10感染A549细胞，噬斑法测定接种后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60和72 h培养液上清中的病毒滴度，绘制log：（病毒滴度）一时间图，分析HAdV-B55在A549细胞中的增殖动力学特征。结果：终浓度含0.5%琼脂糖、2%胎牛血清和1640(2x)细胞培养液为HAdV-B55噬斑形成的最佳条件；MOI=10时，HAdV-B55感染A549细胞后12—15 h培养液中开始出现病毒，接种后15—36 h培养液中病毒量呈指数大量增加，接种后48～60 h病毒量出现小幅上升，接种后60 h细胞完全病变，病毒量增加达到平台期，最终病毒量增加约225 000倍。结论：A549细胞能有效地扩增HAdV-B55，其增殖周期为12—15 h；为研究HAdV-B55的感染致病机制，以及指导后期抗HAdV-B55的药物研发奠定了基础。

[关键词]腺病毒55型；噬斑；增殖动力学；A549细胞

 腺病毒( adenovirus，AdV)是一种没有包膜的直径为70—90 nm的双链DNA病毒。它对人类呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可发生感染，可引起婴儿和儿童急性发热性咽喉炎、胃肠炎，儿童急性出血性膀胱炎、咽结膜热、急性呼吸系统疾病、角膜炎、肺炎、女性宫颈炎和男性尿道炎等。腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，人腺病毒( HAdV)分为A、B（包括Bl、B2亚组）、C、D、E、F组，呼吸道疾病主要由Bl、C、E组腺病毒引起。自2011年以来，我国不同地区先后多次暴发大面积经呼吸道传播的传染病疫情，经检测，病原分别为腺病毒B组7、14、55型。新型HAdV- B55实际上是HAdV-Bll和14的Hexon基因重组突变体，致病能力高于HAdV-Bll和14，是目前引起急性呼吸系统疾病(acute respiratory disease，ARD)的重要因素，感染急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory diseas-es syndrome,ARDS)的病死率最高能达到80%151。在我国，2009年首次出现HAdV-B55疫情的报告，247名师生及市民发病，1名学生死亡；近年来，HAdV-B55在成年人特别是学校和军队特殊人群中引起日趋严重的急性呼吸道传染病流行。近年HAdV-B55引起的成年急性呼吸道传染病流行可能远高于实际报道病例，其潜在的威胁不容小觑。

 目前，临床上并无特效抗呼吸道腺病毒的药物，多数治疗是使用广谱抗病毒药物如西多福韦、利巴韦林、干扰素等，这些药物仅在早期应用具有缩短病程、减轻症状的作用。中药大青叶、穿心莲、板蓝根、苦碟子，以及古方类如蒿芩清胆汤、三仁汤等在中医典籍中有许多对症治疗呼吸道病毒感染的记载，但对腺病毒的抑制活性并不清楚。主要原因在于仍然缺乏用于药物筛选和评价的腺病毒感染模型及检测方法。腺病毒滴度测定有壳蛋白免疫法、荧光定量PCR法、D260n。法、细胞病变CPE法、噬斑法等。前4种方法已有文献报道，但依1日缺乏噬斑方面的实验数据。本研究拟建立检测HAdV-B55滴度的噬斑法，通过对比讨论培养基、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胎牛血清(FBS)、甲基纤维素(MC)、琼脂糖浓度对HAdV-B55噬斑形成的影响，得到最适营养覆盖物配比进行噬斑实验，在此基础上完善HAdV-B55在A549细胞中的增殖动力学实验数据，探讨HAdV-B55型在A549细胞中的增殖动力学特征，从而为研究HAdV-B55的感染致病机制及抗腺病毒药物研发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

 A549细胞为本实验室保存，用含loo/o FBS和1%双抗的1640培养液培养（37C、5% C02贴壁培养，2d传代一次）；HAdV-B55为本实验室保存，贮存于-70。C冰箱中；1640培养液、0.25 %胰酶-EDTA、1640干粉均购自GIBCO公司；双抗（青霉素lXl04 U／mL，链霉素1X104ILg/mL）、FBS为Hyclone公司产品；HEPES缓冲液(l mol/L)为迈晨生物科技公司产品；琼脂糖为北京希凯创新科技有限公司产品；甲基纤维素为Sigma公司产品。

 CO2细胞培养孵箱、生物安全柜、-70℃冰箱、超净工作台均为Thermo Forma公司产品；倒置显微镜为Olympus公司产品；制冰机为SANYO公司产品；Mili-Q超纯水系统为Millipore公司产品。

1.2营养覆盖物的配制

 MC覆盖物：2x培养液与MC溶液按1:1混合（其余成分如FBS、HEPES和双抗等按照需要量预先溶解到2x培养液中），用力摇匀，静置数小时后分装，4℃备用。

 琼脂糖覆盖物：同上述方法现配现用。

 2×培养液：1640干粉9.6 g用500 mL注射用水溶解，加入NaHCO2粉末2g溶解完全，再用1mol/L的NaOH和1 mol/L的HCI溶液调pH值为7.0—7.2，用0.2um滤器过滤，4℃备用。

 2%琼脂糖（或MC）溶液：4 g琼脂糖（或MC）粉末用200 mL热Mili-Q超纯水(75～lOOqC)分散后，室温持续搅拌至液体呈透明的均匀黏稠物，高压灭菌，4℃备用。

1.3  噬斑实验

 A549细胞以4x105／孔接种到12孔板，次日待细胞长至致密单层，用病毒稀释液以400 p4L/孔感染A549细胞，于37C、50/o CO2条件下孵育1 h，吸弃病毒稀释液，用PBS洗2次，加入琼脂糖（或MC）覆盖物，37。C、5% CO2孵育，每日观察噬斑情况，待噬斑明显且不再增多时（第Sd），用4%甲醛溶液同定，用1%结晶紫溶液染色，计数。噬斑形成单位(PFU/mL)=(噬斑数×病毒稀释度×1 mL)/400 VL。

1.4  HAdV-B55在A549细胞中的增殖动力学

 病毒以MOI=10接种A549细胞，37C、5% CO2孵育th，吸弃病毒液，PBS洗2次，加入含20/0 FBS的维持液于37C、50/o CO2孵育，分别于接种后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、72 h收集细胞培养液，噬斑法分别计算病毒滴度。

1.5  实验数据处理

 实验数据用Graphpad Prism 5软件包处理，数值变量采用x+s进行统计描述，以P<0.05为有统计学意义。不同时间点培养液中病毒滴度用噬斑形成单位( PFU/mL)表示，病毒滴度取以2为底的对数后与对应时间做图进行分析。

2结果

2.1琼脂糖（或MC溶液）浓度及FBS对噬斑形成的影响

2x1640分别与不同浓度的琼脂糖（或MC溶液）对半混合均匀，并加入HEPES缓冲液、1010双抗，配制成营养覆盖物。HAdV-B55分别稀释至1／104和1／105后感染12孔板中的A549细胞单层，分别用终浓度含0.5 %、0.7%、1%的琼脂糖（或lo/o MC溶液）与2%、5% FBS正交配比得到的营养覆盖物进行噬斑实验，每组2个复孔。结果发现，HAdV-B55稀释至1／104时，细胞发生大面积病变，无噬斑出现。病毒稀释至1／105时，含1%、0.7%、0.5% MC溶液的覆盖物均未能出斑；终浓度含0.5%琼脂糖2% FBS的覆盖物出斑数量最多，斑点清晰可见；终浓度含0.7%琼脂糖和2% FBS的覆盖物出斑数量较少，斑点直径小；终浓度含1%琼脂糖和5% FBS的覆盖物出斑数量少，斑点直径大（图1）。

2.2  FBS含量对噬斑形成的影响

2%的琼脂糖与过滤注射用水对半混合均匀制成1%的琼脂糖溶液，2x1640再与上述稀释后的琼脂糖溶液对半混合均匀，加入HEPES缓冲液、1%双抗，再分别加入1%( 2%、3%、4%) FBS，配制成营养覆盖物。HAdV-B55分别稀释至1／105和1／106后感染12孔板中的A549细胞单层进行噬斑实验，每组2个复孔。结果发现，覆盖物中FBS为惟一变量时，其含量对噬斑影响显著，含1% FBS的覆盖物在镜下观察第3d少量出斑，第4d出现大面积的细胞病变。病毒稀释至1/10:时，含3%、4% FBS的营养覆盖物出现较少噬斑，噬斑直径小。病稀释至1／106时，含2%FBS的覆盖物出现边缘整齐．清晰的噬斑，易观察计数；含3%、4% FBS的覆盖物噬斑面积较小、甚至无任何斑点，细胞状态良好（图2）。

2.3  营养覆盖物中HEPES缓冲液对噬斑形成的影响

 2x1640分别与1%的琼脂糖对半混合均匀，配制成营养覆盖物，终浓度含或不含HEPES缓冲液、l%双抗、2% FBS。HAdV-B55分别稀释至1／106后感染12孔板中得A549细胞单层进行噬斑实验。结果显示，覆盖物中加入HEPES缓冲液不能显著增加噬斑单位的形成。

2.4  HAdV-B55在A549细胞中的增殖动力学特征

病毒以MOI=10接种A549细胞，孵育l h后吸弃病毒液，换含2% FBS的维持液，分别于接种后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、72 h镜下观察细胞病变情况，同时收集细胞培养液，噬斑法分别计算病毒滴度。镜下观察结果显示，接种HAdV-B55后36 h，细胞出现明显病变，60 h内完全病变。噬斑实验统计结果，HAdV-B55接种A549细胞后3～12 h病毒滴度升高得比较缓慢，接种l2 h后病毒滴度增加约2.8倍，接种后12～15 h病毒出现一个陡升，15h后病毒滴度增加约75倍，15—36 h病毒滴度开始呈指数增高，36 h出现一个陡升，36 h测定的HAdV-B55滴度较第15 h增加约333.3倍，病毒增殖速度逐渐下降，接种后第60 h病毒滴度达到平台期，接种后72 h病毒滴度增加约225 000倍（图3）。

3讨论

 细胞生长的密度和状态是噬斑形成的关键因素，细胞生长密度过低，不宜形成噬斑，如果细胞噬斑直径过小，还会影响后期计数；细胞生长密度过高或状态不好，容易凋亡、脱落。病毒种类不同对琼脂糖浓度的要求不同，浓度太高或太低都会影响噬斑的形成，琼脂糖浓度越高，噬斑直径就越小。血清的浓度是影响细胞生长代谢速度和生长状态的关键因素之一，进一步影响噬斑形成的周期，覆盖物中血清含量过高或过低都会对病毒噬斑造成影响；另外，要保证实验的可重复性，应尽量使用同一类型相同批号的血清。本实验结果显示，HAclV-B55在A549细胞内增殖周期为12～15 h，接种12 h后即有大量病毒颗粒释放出细胞进入培养液，HAdV-B55以10MOI感染A549细胞，60 h内能使细胞完全凋亡，HAdV-B55在A549细胞中增殖代谢活动比较活跃，增殖效率高。综上，我们建立了HAdV-55腺病毒感染A549细胞模型及噬斑实验检测腺病毒滴度的方法，研究了HAdV-55腺病毒在A549中的增殖动力学特征，为探讨HAdV-55的生物学特征、感染致病机制，并为后期筛选具有抗腺病毒作用的药物及中药活性成分提供了重要的方法学基础。