贾晓蒙，张亚楠，罗晓丽，陈滢洁，丁丽华，叶棋浓，吕朝晖
1．解放军总医院内分泌科，北京100853;2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850
——[摘要]目的：构建带有Myc标签的Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的Tau蛋白真核表达质粒，并在真核细胞中表达MyC-Tau3m蛋白。方法：利用重组PCR方法得到Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的编码序列，将其插入经Bam,H I和Kpn, I酶切的pXJ40-Myc表达载体，在人293T细胞中转入空载体和重组质粒，利用Western印迹检测其表达及功能。结果：测序和酶切结果证实Myc-Tau3m真核表达质粒构建成功，转染293T细胞后获得表达，表达产物可促进微管的乙酰化。结论：构建了Thr-213、Thr-235 .Ser-404磷酸化位点突变的Myc-Tau3m真核表达载体，为进一步研究Tau蛋白磷酸化的生理机能奠定了基础。
[关键词]微管结合蛋白Tau；突变体；磷酸化；真核表达
Tau是一种微管结合蛋白，在全部与徽管结合的蛋白中占80%。Tau蛋白的基因位于第17号染色体的长臂，共含有16个外显子，基因全长超过了100 kb，可在转录后通过选择性剪辑mRNA形成6种异构体，每个异构体含有352～441个氨基酸残基，蛋白中央有脯氨酸富集区。
Tau蛋白的主要生理功能是促进微管组装，维持微管稳定，并支持神经元内的轴突运输功能。Tau蛋白过度磷酸化后异常聚集可导致Tau蛋白功能紊乱，并以配对螺旋丝的结构形成神经元纤维缠结，在细胞内聚集引起微管解聚，最后使神经元发生退行性病变。这种神经元纤维缠结现象构成了阿尔茨海默病(AD)的主要病理特征。有研究报道，AD患者脑内神经原纤维缠结数量与临床痴呆程度呈正相关，AD患者临床症状与Tau蛋白缠结由内嗅皮质向海马和大脑皮层浸润趋势相一致，是目前国际评估AD病程进展的金标准。对AD发病机制的探讨和治疗药物的开发是当前AD研究的热点。Tau蛋白的异常磷酸化可能是神经元纤维退变的早期事件。在AD患者脑中和体外实验中都发现许多蛋白激酶和磷酸酯酶共同调节Tau蛋白的磷酸化。迄今，已发现的AD脑中的Tau蛋白异常磷酸化位点有21个，其中10个位点的磷酸化水平较高，对Tau蛋白功能影响较大。Tau蛋白的磷酸化水平受多种激酶的调节，尤其是P38 MAPK（P38丝裂原活化蛋白激酶），在Tau蛋白的磷酸化过程中起着重要作用。P38激酶活性上调是导致Tau蛋白异常过度磷酸化的重要原因。有报道指出，无论在体内还是体外，P38 MAPK均能直接使Tau蛋白磷酸化。Tau蛋白共有85个磷酸化位点，其中79个为丝氨酸和苏氨酸残基。这些位点中与P38 MAPK通路相关的有Ser-46、Thr- 181、Ser- 202、Thr- 205、Thr- 212、Thr- 217、Thr-231、Ser-235、Ser- 356、Ser- 396、Ser-404，其中Thr-213、Thr-235、Ser-404位点在微管解聚中具有重要作用。
Tau蛋白主要与非激动神经元的轴突特异性结合，但当Tau蛋白脯氨酸富集区高度磷酸化时，Tau特异性结合在神经元胞体树突上，因此，Tau蛋白的磷酸化位点在决定其结合伴侣从而实现特异性功能定位的过程中起着重要作用。当Tau蛋白发生过度磷酸化时，P38 MAPK通路在Tau蛋白磷酸化中的生理作用将转变为病理过程，这种病理过程可以促进Tau蛋白与微管解离，此时，神经元中可溶性Tau蛋白会大量增加并引起Tau蛋白自体聚集，从而形成Tau蛋白寡聚体。这些寡聚体可以进一步集合成双螺旋丝，螺旋丝相互聚集最终形成阿尔茨海默病的主要病理特征之一——神经纤维缠结。
我们拟构建Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变的Tau真核表达重组体，探讨Tau蛋白P38磷酸化位点突变对微管聚合的影响。
1材料和方法
1.1材料
293T细胞由本实验室传代培养；载体为本实验室保存；VigoFect南威格拉斯生物技术有限公司生产；限制性内切酶、DNA连接酶、PCR相关试剂盒由TaKaRa公司生产；胶体回收、质粒提取试剂盒购于Promega公司；DMEM及小牛血清购于Gibco公司；测序由博迈德公司完成。
1.2 Myc-Tau3m重组质粒的构建与测序
以乳腺文库为模板，采用上游引物(5'- GAAA ACAAGATGCTCCCAGCCAAGG-3')和下游引物（5'-CCTTGGCTGGGAGCATCTTGTTTTC-3，）PCR扩±曾得到Ser-404位磷酸化位点突变的质粒Tau404。以Tau404为模板，采用上游引物（5，- CGGGATCCATG GCTGAGCCCCGCCAG-3 7）和下游引物（5 7PTGGCG GAAGACGGCCCCTTGGGTGGACCACGGACCACTG C-3一），同时以Tau404为模板，采用上游引物（5 7一G CAGTGGTCCGTGGTCCACCCAAGGGGCCGTCTTCC GCCA-3')和下游引物（5，- GGGGTACCTCACAAACCCTGCTTGGC-3'）进行PCR扩增（反应条件：95℃预变性5 min;95。C变性30 s，60qC退火30 s，72。C延伸3 min 10 s，29个循环；72C继续延长7 min），用胶回收试剂盒回收PCR产物。以上述步骤回收的2段片段为模板，用上游引物(5，_ CGGGATCCATGGCTGAGCCCCGCCA-3')和下游引物(5，- GGGGTACCTCACAAACCCTGCTTGGC-3')行PCR扩增，反应条件相同，将PCR产物回收。用BamH I和Kpn, I双酶切pXJ40-Myc载体，用10 g/L琼脂糖电泳回收载体大片段。用BamH I和Kpn I双酶切回收纯化后的扩增片段，选择T。DNA连接酶将酶切片段和载体按一定比例连接，转化大肠杆菌，随机挑选菌落培养，提取质粒，用BamH I和Kpn I对所提质粒进行双酶切鉴定。将酶切鉴定无误的质粒送北京博迈德生物公司测序。
1.3 细胞转染和Western印迹检测
将培养于含10%胎牛血清和10%双抗的DMEM培养基中的293T细胞接种于6 cm培养皿中，转染时细胞密度达80%，于转染前1 h换液，接种24 h后转染。把4 p4L VigoFect和200 VL NaCl混合，把2 y,g重组质粒与200 p.L NaCl混合，将上述2种混合物混匀后室温放置15 min，继而加入培养皿中；相同条件转染pXJ40- Myc质粒作为对照。37。C、5% CO2常规培养，4h后换液；转入质粒后24 h收集细胞并裂解，加入2xSDS缓冲液，煮沸15 min，高速离心5 min i后取上清行SDS-PAGE并转至硝酸纤维素膜上；用TBST配制5010的脱脂牛奶将膜封闭1h，将HRP标记的抗Myc抗体用上述配好的5%脱脂牛奶按1：3000稀释；将抗GAPDH抗体按1：5000稀释；次日把鼠抗IgG抗体用5%脱脂牛奶按l：5000稀释，室温轻摇2h，TBST洗膜3次x5 min;将显影剂A液和B液按1:1混匀并附膜反应5 min后显影。
1.4 细胞转染和Western印迹检测Myc- Tau3m对tublin乙酰化的影响
用6 cm皿培养293T细胞，接种量以转染时细胞密度达80%为宜，培养24 h后进行转染，转染前1 h换液。分别转染pXJ40-Myc、Tau、Myc-Tau3m质粒，37℃、5% CO2常规培养，4—6 h换液。质粒转染293T细胞24 h后收集细胞蛋白，加入2xSDS加样缓冲液，煮沸10 min，高速离心2 min，取上清液行SDS-PAGE后电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉以1：200稀释的抗AC-tubulin鼠单克隆抗体、1:200稀释的抗tubulin鼠多克隆抗体、1：5000稀释的用HRP标记的抗Myc标签鼠单克隆抗体，室温轻摇th，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。
2结果
2.1 Myc-Tau3m重组质粒的构建和鉴定
以pXJ40-Tau为模板，PCR扩增404位磷酸化位点上、下游片段，得到片段1(1200 bp)和片段2(100 bp)，并用重组PCR法将2条片段进行连接，得到全长片段(1300 bp)，即为突变体PCR产物S404A（图1）。以S404A为模板，PCR扩增Thr-213、Thr-255位磷酸化位点上、下游序列，得到片段3 (550bp)和片段4(500 bp)，与预期结果一致。以片段3、4为模板进行第二次PCR扩增，得到T213A/T235A/S404A突变的全长序列(1300 bp)（图2）。用BamH I和Kpn, I对片段和Myc载体进行双酶切，用T。DNA连接酶将酶切片段和载体连接，转化大肠杆菌，挑选菌落行菌液PCR，空载体酶切后仅获得空载体，挑选的阳性克隆酶切后得到约1300 bp的目的片段（图3），进一步认定筛选出了阳性Myc-Tau3m质粒克隆。测序结果证实Thr-213、Thr-255和Ser-404成功突变为Ala。
2.2质粒真核转染表达鉴定
将测序无误的质粒转入293T细胞，以HRP标记的抗Myc标签鼠单克隆抗体检测Tau的表达．West-ern印迹结果可见相对分子质量约55Xl03处有特异性条带，而空转组显示阴性（图4）。表明Tau基因在293T细胞中得到表达。
2.3 Myc-Tau3m促进微管蛋白的乙酰化
Tau的磷酸化抑制微管的聚合，而微管的聚合可以用微管蛋白的乙酰化来检测，微管聚合的程度越高，微管蛋白的乙酰化水平越高。因此，Tau的磷酸化抑制微管蛋白的乙酰化。为了检测Myc-Tau3m对微管聚合的影响，将野生型Tau质粒和Myc-Tau3m质粒转染MCF-7细胞，检测其对微管蛋白乙酰化的影响。结果显示，与空载体相比，Tau使微管蛋白的乙酰化增强，而Myc-Tau3m进一步增强了微管蛋白的乙酰化（图5）。
3讨论
Tau的功能多样，近年发现，Tau蛋白与肿瘤具有一定关系。国外研究表明，在乳腺癌中Tau蛋白高表达与紫杉醇耐药有关，研究结果显示在经紫杉醇联合化疗并得到完全缓解的乳腺癌患者中，70%的肿瘤组织不表达Tau蛋白，而在采用他莫昔芬治疗的乳腺癌患者组Tau蛋白却呈现高表达状态，雌激素受体(ER)阳性患者的兀复发时间明显更长，提示Tau蛋白高表达在内分泌治疗中可以作为很有价值的预测因子。现有研究证实，在神经细胞中微管是稳定细胞骨架和支持物质运输的主要结构，而Tau蛋白作为一种微管相关蛋白在此过程中扮演着重要角色。Tau的磷酸化或过度磷酸化是正常生理功能维持和神经系统疾病发生中的关键环节。当Tau蛋白发生过度磷酸后，会以配对螺旋丝的形式在细胞内形成神经纤维联结并异常聚集，继之引起神经元的慢性退行性病变。Tau蛋白的过度磷酸化由多种激酶共同调节，其中P38 MAPK和GSK-3(3的作用最为重要。P38 MAPK除可以自身磷酸化Tau蛋白多个位点外，还可以通过对Tau的预磷酸化增强GSK-3B对Tau的磷酸化作用。现已发现Tau蛋白约有21个高度异常磷酸化位点，其中至少10个是脯氨酸指导的，另有15个位点于丝氨酸残基上，还有6个位点在苏氨酸残基上。Tau蛋白异常磷酸化是阿尔茨海默病的主要病理过程，Tau蛋白异常磷酸化可以导致神经纤维缠结的形成，P38MAPK是该病理过程中最重要的激酶之一。P38MAPK等激酶可以通过多个位点催化Tau磷酸化，但是对各位点的磷酸化作用效果却不尽相同。虽然有很多关于Tau蛋白的报道和研究，但Tau蛋白异常磷酸化过程中各个位点的作用效应并未完全阐明。
本实验构建了Thr-213、Thr-235、Ser-404共3个磷酸化位点突变的克隆质粒Myc-Tau3m，并在真核细胞中获得表达，验证了其可促进微管的乙酰化，提示Tau的磷酸化在乳腺癌耐药中可能发挥作用。我们的工作为进一步研究Tau蛋白磷酸化在乳腺癌中的功能奠定了基础。
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